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γδT细胞在机体的免疫防御和免疫调节过程中发挥着重要作用,但目前对其抗原识别谱的认识还很局限,尤其是γδT细胞对脂类抗原的识别还知之甚少。澄清γδT细胞与脂类抗原之间的相互作用机制,可为进一步阐明γδT细胞在免疫学中的地位,全面描绘免疫应答的本质提供了重要线索和实验依据,并也为免疫学应用提供新的策略与手段。本论文旨在研究人类γδT细胞对lipidA(LA)的识别机制,初步探讨LA反应性γδT细胞的TCRδ-CDR3长度及序列特点,以及进一步阐释LA反应性γδT细胞的免疫学功能。(一)人类γδT细胞对LA识别机制的研究LA是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的重要组成部分和生物活性中心,具有较强的免疫原性。本研究集中讨论了如下问题:人类γδT细胞对其识别的机制究竟如何?是否需要抗原提呈细胞的作用?如果需要,那么其分子机制是什么?与哪种抗原提呈分子相关?LA反应性γδT细胞的TCR又有什么样的特征可寻?针对以上问题,首先,我们分别应用流式分析技术、~3H-TdR掺入实验和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)染色方法分别检测了在加与不加单核细胞来源的树突状细胞(monocyte-derived dendritic cell,moDC)情况下,LA诱导人外周血来源的γδT细胞的增殖情况;其次,分别使用抗CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、TCRγδ、LA、MHCⅠ和MHCⅡ抗体对LA诱导的γδT细胞增殖过程进行阻断;再次,对LA反应性γδT细胞的TCRδCDR3区序列进行测定,并使用基因扫描技术分析其长度特征;最后,分析了在抗CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、TCRγδ、LA等抗体存在和不存在情况下,LA对γδT细胞刺激引发的包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10在内的细胞因子分泌情况。结果表明,人类γδT细胞与LA相互作用过程中,当moDC存在时,LA能诱导γδT细胞明显增殖,而无moDC存在时,基本上观察不到γδT细胞有增殖现象;在各种抗体阻断实验中,只有抗CD1b、CD1c、TCRγδ和LA的抗体能明显阻断LA诱导的γδT细胞增殖,而其它抗体没有此阻断效应;另外,我们进一步验证了抗CD1b和抗CD1c抗体之间没有交叉阻断功能;基因扫描结果发现LA反应性γδT细胞的TCRδCDR3区的片断长度各不相同,但有长度约为75bp的优势片段,对LA反应性γδT细胞的TCRδCDR3区的序列分析的结果表明没有发现有特异性氨基酸序列,但发现其优势氨基酸序列的组成是TDRV2D-J1;LA反应性γδT细胞主要分泌Th1类细胞因子,尤其是IFN-γ和TNF-α,并且与功能阻断实验结果一致,抗CD1b、CD1c、TCRγδ和LA的抗体能完全阻断γδT细胞分泌细胞因子。上述结果说明γδT细胞在识别LA的过程中,需要抗原提呈细胞的提呈作用,而且该过程是受CD1b和CD1c的限制,并依赖于TCRγδ。这一发现丰富γδT细胞识别脂类抗原的认识,为丰富γδT细胞识别抗原机制理论、全面描绘免疫应答的本质提供了依据。另外,我们的结果表明LA反应性γδT细胞的TCRδCDR3区的序列没有发现高度保守的,但无论其长度还是氨基酸序列组成都有优势序列存在,这为进一步寻找LA高度特异性的人类γδT细胞克隆和高度亲和力的TCRγδ序列提供了线索,并奠定了基础。(二)LA反应性γδT细胞的功能研究我们主要研究内容如下:LA反应性γδT细胞对E.coli的直接细胞毒功能研究;LA反应性γδT细胞对自体巨噬细胞吞噬功能的调节作用研究;LA反应性γδT细胞对B细胞产生抗LA抗体的调节功能研究。首先,我们通过氧化还原染料-碘硝基四氮唑(p-iodonitrotetrazolium,INT)和联甲苯四唑氯(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chlorid,CTC)还原生成相应的产物四唑甲(INF和CTF)的量,在LA反应性γδT细胞与E.coli共孵育4hr后,测定Ecoli的生物活性。结果发现,E.coli的生物活性在与LA反应性γδT细胞孵育后较孵育前有非常显著的降低(P<0.01);并且随着效应细胞-LA反应性γδT细胞数量的增加及反应时间的延长,Ecoli的生物活性越来越弱。以上结果提示LA反应性γδT细胞对E.coli的确具有细胞毒作用,但是作用机制有待于进一步澄清。其次,通过构建绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的原核表达载体pET-22b(+)-GFP,并用IPTG诱导该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,然后利用这种表达绿色荧光蛋白的E.coli(E.coli-GFP)来检测巨噬细胞的吞噬功能。使用流式细胞仪技术分析与LA反应性γδT细胞共孵育前后的吞噬了E.coli-GFP的巨噬细胞百分比的差异。结果提示,两组中Ecoli-GFP~+巨噬细胞百分含量有显著差异,LA反应性γδT细胞能促进自体巨噬细胞的吞噬功能。最后,我们利用人源化Severe combined immune deficiency(SCID)小鼠检测LA反应性γδT细胞是否能够调节B淋巴细胞产生抗LA抗体的功能。SCID小鼠腹腔接种人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)后2周,通过检测其外周血中是否含有人类抗体来鉴定其免疫重建是否成功。然后,对免疫重建成功的小鼠用LA进行免疫,其中部分实验组小鼠同时腹腔注射LA反应性γδT细胞,隔周进行LA加强免疫。然后分别在免疫后的第2、3、5、8、10周断尾取血,用ELISA方法检测血清中抗LA抗体含量。结果发现,分别在第3和第5周,加LA反应性γδT细胞组小鼠血清中抗LA抗体含量明显高于未加LA反应性γδT细胞组(P<0.05)。结果提示,LA反应性γδT细胞可能会增强B淋巴细胞产生抗体的功能。上述结果不仅阐明了LA反应性γδT细胞不仅对E.coli的活性有直接抑制作用,而且能够调节巨噬细胞和B淋巴细胞对细菌的清除,这为γδT细胞桥接固有免疫和获得性免疫的理论提供了实验支持。