【摘 要】
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多子小瓜虫（Ichthyophthirius multifiliis）是一种纤毛类原生动物,对宿主没有严格的选择性,可以感染大多数的淡水鱼类甚至两栖类,由其引起的淡水鱼类疾病俗称小瓜虫病或“白点病”。由于其致死率高、爆发快,对淡水鱼养殖业造成了极大的威胁,目前尚无有效的防治方法,因此本研究拟通过构建多子小瓜虫核酸疫苗以期达到预防多子小瓜虫的目的。将实验所用多子小瓜虫DNA,经PCR扩增测序后,与N
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多子小瓜虫（Ichthyophthirius multifiliis）是一种纤毛类原生动物,对宿主没有严格的选择性,可以感染大多数的淡水鱼类甚至两栖类,由其引起的淡水鱼类疾病俗称小瓜虫病或“白点病”。由于其致死率高、爆发快,对淡水鱼养殖业造成了极大的威胁,目前尚无有效的防治方法,因此本研究拟通过构建多子小瓜虫核酸疫苗以期达到预防多子小瓜虫的目的。将实验所用多子小瓜虫DNA,经PCR扩增测序后,与NCBI网站所载多子小瓜虫β-微管蛋白基因序列（登录号:XM＿004037588.1）比对验证。以该基因为抗原,p VAX1质粒为载体构建多子小瓜虫β-微管蛋白核酸疫苗。将实验所用的草鱼分为注射生理盐水的空白组、注射空载质粒的空载组、注射核酸疫苗的免疫组,在初次免疫4周之后以相同剂量进行加强免疫。免疫注射后,对比免疫组、空载组和空白组的免疫指标及存活率。攻毒实验在二次加强免疫后第2周开始,感染密度为1000掠食体/100m L。主要研究结果如下:通过对空白组、空载组、免疫组草鱼血液中mRNA的检验,验证抗原基因多子小瓜虫β-微管蛋白在免疫组鱼体内顺利表达;多子小瓜虫核酸疫苗对多子小瓜虫感染有较好的免疫作用,与空白组和空载组对照相比,免疫组存活率更高,免疫保护率可达70.0%;用ELISA法检验草鱼血清中多子小瓜虫β-微管蛋白抗体,其结果表明,只有免疫组的检测结果为阳性,且持续至第十三周,而空白组和空载组的检测结果均为阴性,表明仅有免疫组的实验鱼体内产生了对多子小瓜虫β-微管蛋白的特异性抗体;血清凝集效价的实验结果表明,三组实验鱼的血清均能使多子小瓜虫掠食体凝集死亡,但免疫组血清效价最高且免疫时长最长,空白组的免疫时长最低效价最低,空载组则介于两者之间;IgM含量测定结果表明特异性免疫球蛋白IgM的含量在首免和次免后均先升高后降低,次免后IgM含量增幅显著（P＜0.05）高于首免后,并在第六周达到峰值。空载组的IgM含量呈现小幅度上升后下降的趋势,且各周空载组和空白组IgM含量均低于免疫组。由此可知,免疫组草鱼的特异性免疫反应更为强烈,产生了更多的免疫球蛋白,对预防包括多子小瓜虫在内的病原体均有帮助。且在次免后升高幅度显著增大（P＜0.05）,说明再次的抗原刺激激活了免疫记忆细胞,快速地产生了大量的免疫球蛋白,帮助鱼体抵御多子小瓜虫的入侵。非特异性免疫指标测定结果显示相较于空白组,空载组和免疫组的SOD、MDA、ACP、AKP以及皮质醇非特异性免疫指标在初免和次免后均有所上升,但免疫组的峰值和升高持续时间更长,说明疫苗能提升鱼体的非特异性免疫功能,空载质粒在这方面也有一定的效果;对MHⅡ-DAB1、MHCⅠ、IRAK-I、MyD88这4个与多子小瓜虫免疫相关的基因测定其实时荧光定量表达量,实验结果显示MHCⅠ、IRAK-I、MHⅡ-DAB1、My D88这4种与免疫相关的基因表达量在首免和次免后均上调,呈现先升高后下降的趋势,但只有IRAK-I和My D88的基因表达与对照组有较大差异,次免后则是所有基因的上调量均升高且高于首免后,MHⅡ-DAB1、MHCⅠ、IRAK-I、My D88基因表达量均高于空载组和空白组,变化趋势与首免类似,但峰高有所增大。说明当鱼体受到疫苗刺激时,免疫相关基因均会出现上调,也佐证了免疫组的免疫应答更强烈。
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