【摘 要】
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目的:将能够表达犬FGF21的真核质粒pCMV3-His-dFGF21转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHOK-1)中,利用潮霉素B进行筛选,获得稳定表达犬FGF21的CHOK-1细胞系;利用该重组细胞系对犬FGF21进行表达,获得具有生物学活性的犬FGF21;对该细胞系的培养工艺、表达条件进行优化,为犬FGF的工艺化生产提供理论实践依据,为犬FGF21的宠物用药研制奠定基础。方法:利用三种不同转染方法:
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目的:将能够表达犬FGF21的真核质粒pCMV3-His-dFGF21转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHOK-1)中,利用潮霉素B进行筛选,获得稳定表达犬FGF21的CHOK-1细胞系;利用该重组细胞系对犬FGF21进行表达,获得具有生物学活性的犬FGF21;对该细胞系的培养工艺、表达条件进行优化,为犬FGF的工艺化生产提供理论实践依据,为犬FGF21的宠物用药研制奠定基础。方法:利用三种不同转染方法:脂质体转染法?磷酸钙沉淀法?电穿孔法对真核质粒pCMV3-His-dFGF21进行转染,Western blot法验证蛋白表达情况,筛选最适转染方法。潮霉素B筛选法构建稳定表达犬FGF21的CHO细胞系,RT-PCR和Western blot验证转染效果,绘制生长曲线监测细胞生长情况,使用CCK8监测细胞活力以评价细胞状态,对稳转细胞系进行理化性质鉴定。设计正交实验,对血清浓度(8%?10%?15%)?细胞接种密度(30%?40%?50%)和不同表达时长(36,48,72 h)三种细胞培养与蛋白表达条件进行研究,利用SDS-PAGE蛋白电泳以及Gel Quant Express软件分析FGF21表达情况,优化稳转细胞系培养条件。超声法破碎细胞,Ni-Agarose亲和层析法对蛋白进行柱纯化,获得大量FGF21,并对其理化性质进行鉴定。结果:比较三种转染方法,确定脂质体转染细胞效果最佳。使用MTT法检测细胞活力,得到最佳潮霉素B筛选浓度为200μg/mL,并成功筛出表达犬成纤维细胞生长因子蛋白FGF21的细胞系,RT-PCR和WB结果显示,该细胞系能够成功表达犬FGF21蛋白,稳转细胞系构建成功;根据正交试验优化出最适表达条件:细胞接种密度40%?血清浓度为15%?表达时间为72 h。目标蛋白在100 mmol/L的咪唑条件下被成功洗脱纯化。结论:选用阳离子脂质体转染法转染细胞,潮霉素B筛选成功得到稳定表达犬成纤维细胞生长因子FGF21细胞系,对该细胞系的培养条件进行优化后,目的蛋白可有效表达,并对该蛋白进行纯化,为接下来探究蛋白功能提供了实验依据。
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