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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。PRRS自1987年首次报道发现于美国以来,现已遍及世界各主要养猪国家与地区,并己成为危害养猪业最严重的传染病之一。2006年夏季我国南方诸省暴发“猪无名高热病”,损失严重,持续流行,造成全国十几个省发生疫情,其中PRRSV是最主要病原。细胞因子在病毒免疫和致病方面的作用非常重要。IL-8是1987年Yoshimur发现的第一个趋化性细胞因子,属于C-X-C趋化因子超家族中的一个成员。IL-8属于调节炎症的介质,对细菌和病毒感染引发的炎症和免疫过程有重要的调节作用。已有试验证明猪感染PRRSV后能诱导体内IL-8的产生,但PRRSV诱导IL-8机制并不清楚。鉴于此,我们开展了PRRSV感染Marc-145细胞诱导IL-8产生的机制的研究,主要内容包括:1.PRRSV感染Marc-145细胞激活IL-8将由白细胞介素8(IL-8)全长启动子驱动的荧光素酶报告质粒pIL-8-luc与荧光内参质粒pRL-TK转染Marc-145细胞,24h接种PRRSV CH-1a株,经荧光素酶活性检测发现PRRSV感染后3h内能显著激活IL-8,感染后6h激活倍数更高,之后逐渐降低。由此PRRSV感染Marc-145细胞以后可以激活IL-8,且感染后6h激活倍数最高。2.PRRSV N蛋白和Nsp2蛋白在Marc-145细胞中表达能激活IL-8为了确定PRRSV的哪种编码蛋白参与了诱导IL-8,将编码PRRSV结构蛋白和非结构蛋白的真核表达质粒分别与pIL-8-luc及pRL-TK共转染Marc-145细胞,36h后检测荧光素酶活性,发现结构蛋白N和非结构蛋白Nsp2能激活IL-8,而其他编码蛋白则无明显的激活作用。3.PRRSVN蛋白和Nsp2蛋白激活IL-8的必需区域N蛋白和Nsp2蛋白在Marc-145细胞中的表达能激活IL-8。为了确定N蛋白和Nsp2蛋白诱导IL-8产生的确切结构域,构建了N蛋白和Nsp2蛋白的缺失突变体真核表达质粒。利用荧光素酶报告系统检测,发现N蛋白发挥作用的主要是其30-73位氨基酸区域,该区域包含了N蛋白的NLS区域、NoLS区域和RNA结合区;但没有发现Nsp2蛋白激活IL-8的特定区域。4.PRRSV感染Marc-145细胞激活IL-8信号通路的研究为了解PRRSV感染Marc-145细胞诱导IL-8产生的信号通路,将由IL-8全长启动子驱动的荧光素酶报告质粒pIL-8-luc、由IL-8编码区上游133bp的启动子驱动的荧光素酶报告质粒-133bp-luc、以及在-133bp-luc基础上分别在NF-κB、AP-1和NF-IL-6转录因子结合位点进行位点突变的突变体NF-κBmut-luc、AP-1mut-luc、NF-IL-6mut-luc分别与内参质粒pRL-TK转染Marc-145细胞,24h后接种PRRSV CH-la株,接毒后6h检测荧光素酶活性,发现NF-κBmut-luc、NF-IL-6mut-luc转染组感染PRRSV后IL-8没有明显激活,而pIL-8-luc、-133bp-luc及AP-1mut-luc转染组感染PRRSV后均可以明显激活IL-8启动子活性,即NF-κB及NF-IL-6两个转录因子结合位点突变后不能诱导IL-8的表达,说明NF-κB及NF-IL-6两个转录因子对于PRRSV激活IL-8十分重要。为了解MAPK信号通路是否参与IL-8的激活,利用MAPK三条通路(p38、JNK、ERK)的抑制剂分别处理共转染了pIL-8-luc及pRL-TK的Marc-145细胞,PRRSV感染后测荧光素酶活性,发现ERK通路的抑制剂对IL-8的激活有一定的抑制作用,而p38和JNK的抑制剂都没有明显的抑制效果,说明MAPK通路中的ERK通路参与诱导IL-8。