论文部分内容阅读
多倍体现象与机体的正常发育是不相容的，哺乳动物胚胎在正常发育过程中存在微弱几率(小鼠大约为0.1％)的自发多倍体现象，通常会导致流产或胎儿脊柱、骨骼、面部畸形等发育缺陷。在生命科学研究中，四倍体胚胎可以作为研究机体发育的有力工具，例如，用它来研究早期胎儿发育过程中调节细胞体积、数目以及分裂速率的机制，也可以用它来改变双亲基因组在子代中的分配比例；更为重要的用途是通过四倍体补偿作用获得完全由ES细胞发育而来的个体，ES小鼠的获得对基因功能的分析、疾病动物模型的建立有十分重要的意义。为充分估计四倍体补偿作用，就必须对因遗传背景引起的小鼠四倍体胚胎发育能力的不同进行研究。本实验通过电融合法由多种遗传背景的小鼠分别获得了四倍体胚胎，并对其电融合效率、附植前和附植后发育能力、与ES细胞构建嵌合胚的发育能力进行了比较。
不同遗传背景的小鼠四倍体胚胎的电融合效率存在显著差异:在融合电压为100V/mm，脉冲时程2×50μsec条件下远交系小鼠胚胎B6D2F2和B6C3D2F2的融合率显著高于近交系C57,ICR和BALB/c(P<0,05)。
四倍体胚胎在体外的发育情况也受其遗传背景的影响:附植前发育阶段，在桑椹胚发育率和囊胚发育率上(B6D2F1xB6D2F1)F2和(B6C3F1×xB6D2F1)F2品系的四倍体胚胎都显著高于C57和BALB/c品系的四倍体胚胎(P<0.5)，远交系和近交系遗传背景的小鼠四倍体胚胎囊胚细胞数目相比具有显著差异(P<0..5或P<0.01)；附植后发育阶段，不同遗传背景的小鼠四倍体胚胎着床率间不存在显著差异(P>0.05)，远交系的小鼠四倍体胚胎得到5只发育至13.5dpc(days post coitum,dpe:)的胎儿，近交系的4n小鼠胚胎无一发育至11.0dpc。
因为ES细胞的多能性会受到多次传代以及冻融的影响，因此需要在本实验室条件下建立起ES细胞稳定的分离培养和鉴定体系。本实验以3-5代ICR小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层，利用高糖DMEM作为基础培养基，同时添加15％的新生犊牛。清、0.1mM的2-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸、2mM的谷氨酰胺和青、链霉素各50IU/ml、LIF(白血病抑制因子)2000IU/ml。5％CO2、饱和湿度、37℃C培养，培养于囊胚贴壁后第5-6天离散Outgrowth(内细胞团增殖体)，分别由43枚C57BIJ6J×129/Sv囊胚、38 枚(C57BL,/6J×DBA/2)Fl×129/Sv囊胚、49枚(C57BL/6JxC3H/HeJ)F1×129/Sv囊胚和9l枚B6C3F1xB6D2F1囊胚得到4株、3株、4株和3株ES细胞系。选择一株具有高度杂合背景的B6C3F1xB6D2Fl ES细胞系进行核型分析、畸胎瘤实验后与ICR品系2n胚胎构建嵌合体并得到具有生殖系传递能力的嵌合体小鼠(通过毛色判断)，证明此细胞系具有生殖系嵌合能力。
利用同一株具有生殖系嵌合能力的杂合背景ES细胞与不同遗传背景(ICRxlCR、C57xC57、BALB/cx BALB/c、(B6D2FIxB6D2FI)F2和(B6C3F1xB6D2F1)F2)的四倍体胚胎构建ES:4n嵌合体，结果由B6C3FlxB6D2Fl背景的ES细胞与B6C3D2F2和B6D2F2四倍体胚胎构建的3只嵌合体，移植其它嵌合胚的假孕鼠无一妊娠。以上结果说明，远交系小鼠四倍体胚胎比近交系小鼠四倍体胚胎具有更好的发育能力。