钙调蛋白对豚鼠心室肌细胞Cav1.2钙通道的剂量依赖性和钙依赖性作用前言电压门控型L型钙通道是介导钙离子进入细胞内的重要途径，进而导致细胞内多种钙依赖性调控过程的发生，如兴奋产生、肌肉收缩、激素和神经递质的分泌及基因表达等。L型钙通道的一个重要特征是rundown，主要表现为细胞膜被破坏后通道活性的丧失，在inside-out的膜片中比较容易观察到rundown。本课题组近期实验表明钙调蛋白（Calmodulin，CaM）和三磷酸腺苷（ATP）是能够逆转钙通道rundown的重要活性因子。CaM是广泛存在于细胞内的一种重要的钙结合蛋白，在心肌细胞，它可以直接或间接调节心肌兴奋收缩偶联以及其它重要的生理过程。心脏L型钙通道（Cav1.2）是CaM作用的重要靶点，通过与钙通道α₁亚单位的C末端结合来介导钙依赖性失活(Ca²⁺-dependent Inactivation，CDI)和钙依赖性激活(Ca²⁺-dependent Facilitation，CDF)两个不同的过程。近年的研究提示CaM与L型钙通道的直接结合是介导CDI和CDF的首要步骤。CaM在细胞内以两种形式存在，即无钙CaM（apoCaM）和钙结合型CaM(Ca²⁺/CAM，包括Ca²⁺饱和型和非饱和型CaM)。据报道，apoCaM结合于L型钙通道并对通道的CDI和CDF起到Ca²⁺感受器的作用。CaM对CDI和CDF的双向调节作用提示在L型钙通道C末端可能存在CaM的多个结合位点。目前在提出的数个CaM结合序列中，IQ基序被证实为CDI和CDF所必需的序列。此外，其它序列如A基序、C基序、EF hand和N末端等均可与CaM结合，由此可见，CaM介导的对钙通道调控的分子机制是非常复杂的。本实验利用膜片钳内面向外模式观测了CaM对L型钙通道的钙依赖性和剂量依赖性作用，进一步揭示其对钙通道调控的分子机制。方法1、单一心室肌细胞的制备健康成年豚鼠一只（体重300～500g），雌雄不限，苯巴比妥钠(30mg·kg^-1)腹腔注射麻醉后，在人工呼吸机支持下进行主动脉插管。取出心脏，用胶原酶分离豚鼠心室肌细胞，将分离的细胞置于4℃冰箱稳定1h后使用。2、野生型CaM和突变型CaM₁₂₃₄的制作、提取与纯化应用RT-PCR方法扩增CaM编码序列并克隆至载体，应用QuickChange突变试剂盒使野生型CaM序列的4个EF-hand基序发生单点突变。使连有CaM和CAM₁₂₃₄序列的质粒载体先后在E.coli XL1-blue和E.coli BL21中高效表达。用IPTG诱导GST融合蛋白的表达，反复冻融方法分离融合蛋白并用GlutathioneSepharose 4B进行纯化。用PreScission protease切去融合蛋白的GST部分得到纯化的目的蛋白。3、膜片钳记录和数据分析应用膜片钳单通道记录模式监测钙通道活性。首先形成细胞贴附式并记录电流2min，然后将膜片自细胞游离建立膜内面向外模式。电流记录1min后，将游离膜片小心移入浴槽旁边充满测试溶液的凹槽中，并连续记录电流20min。利用Ba²⁺负载记录钙通道电流，通过钙通道的钡电流由从-70至0mV的去极化脉冲引出，波宽200ms，刺激频率0.5Hz，数据经由膜片钳放大器记录后以3.3kHz的采集速率输入计算机，减去漏电流。由于I=N×Po×i，测定实验脉冲开始后5～105ms期间的平均电流（I）并除以单通道电流幅值（i）可获得通道开放频率（NPo），其中N为膜片中的通道数目，Po为通道的平均时间开放概率。实验结果用均值士标准误表示，数据处理用Student’s t检验分析。P＜0.05为差异显著。结果1、CaM+ATP对钙通道活性的剂量依赖性作用应用膜片钳细胞贴附模式及膜内面向外模式记录单通道钙电流。当游离Ca²⁺浓度为100nM时，膜片游离后1分钟给予CaM+ATP可使钙通道活性恢复。与细胞贴附式的NPo相比，低浓度和中等浓度的CaM（0.7，1.4，2.1μM）分别使通道活性达97.5±32.5％（n=6），141.8±40.3％（n=8）和221.6±75.0％（n=9）。但是高浓度的CaM（3.5和7.0μM）却使通道活性恢复较少，分别达对照的64.6±28.3％（n=11）和20.2±11.7％（n=7）。在同一细胞上，2.1μM CaM+ATP能够明显增加通道的活性，但是当给予7.0μM CaM+ATP时却使恢复的通道活性受到了抑制。2、CaM+ATP对钙通道活性的钙依赖性的作用在内面向外模式下，同一浓度的CaM对通道活性的作用随钙离子浓度不同而发生变化。当游离Ca²⁺浓度为0、250和500nM时，1.4μMCaM分别使通道NPo达细胞贴附式的89.6±21.0％（n=7），219.8±71.1％（n=10）和36.0±12.6％（n=7）。3、rundown时间为1min时CaM对通道的作用与磷酸化及脱磷酸化无关CaMKⅡ抑制剂KN-62（10μM）以及非特异性蛋白激酶抑制剂K252a（10μM）并不能阻滞CaM对通道的作用，提示了CaM的作用并非由CaMKⅡ和任何其它蛋白激酶所致的磷酸化来介导。在2μMCa²⁺浓度时，cyclosporinA（1μM）并不影响0.35μM CaM对钙通道活性的作用，提示在高钙浓度时CaM对通道的作用与PP2B介导的脱磷酸化无关。4、钙离子浓度影响了CaM对通道的亲和力在一定Ca²⁺浓度时，激活和失活相比需要较低的Kd值。随着Ca²⁺浓度的升高，激活和失活的Kd值均降低。这说明Ca²⁺增强了CaM对通道的亲和力。另外，此结果也说明了通道上有两个独立的效应位点与CaM相互作用并诱导产生不同的调控作用。5、CaM₁₂₃₄+ATP对钙通道活性的作用将游离膜片暴露于含有不同Ca²⁺浓度的CAM₁₂₃₄+ATP测试溶液中，结果显示当游离Ca²⁺浓度由0增至250nM时，3.5μM CAM₁₂₃₄+ATP诱导的钙通道的活性基本保持不变。与野生型CaM一致的是，当游离Ca²⁺浓度增至微摩尔水平时，CAM₁₂₃₄诱导的钙通道活性恢复较少，另外，似乎只有失活相出现了钙依赖性左移。因此，高钙状态下通道活性恢复的显著差异以及CAM₁₂₃₄诱导的失活相的左移提示在微摩尔钙浓度时L型钙通道的调控可能存在一个独特的分子机制。6、等高线图展示了Ca²⁺和CaM对通道活性的交互作用从等高线图可以看出通道活性对CaM和Ca²⁺依赖性的几个显著特征。（1）钙通道活性的产生需要一定浓度的CaM，大约在0.1-10μM范围内。CaM作用峰值的左侧和右侧分别代表激活相和失活相。（2）随着Ca²⁺浓度的升高，“CaM窗”向左移动（即低浓度侧）。（3）在高钙浓度时，任何浓度的CaM均不能诱导通道活性。结论1、CaM可以直接诱导Cav1.2钙通道的激活和失活，而且这种作用是钙依赖性的。2、Ca²⁺／CaM对钙通道的作用与磷酸化和脱磷酸化无关。3、CaM在钙依赖性激活和失活中发挥钙离子感受器作用，四个钙离子结合位点突变的CAM₁₂₃₄取消了钙依赖性激活和失活。4、Cav1.2钙通道C和／或N末端存在两个独立的作用位点分别介导通道的激活和失活。5、EF hand基序可能参与了高钙浓度时通道的失活。