质谱法(Mass Spectrometry,MS)是一种高灵敏的多组分同时检测的分析技术,使用串联质谱还能获得化合物的结构信息。电喷雾电离(Electrospray Ionization,ESI)是一种能将溶液中的极性分子转变为气相离子的技术,是质谱分析中最重要的离子源之一,广泛应用于蛋白质、代谢物、脂类、核酸等生物分子的离子化。电喷雾离子化质谱(ESI-MS)分析中最大的挑战是在复杂基质中实现目标分子的高效离子化。通常可以使用各种前处理操作对目标分子进行分离和纯化,以减轻基质对目标分子离子化的不利影响。由于体积的限制,单细胞样品难以直接使用常规的前处理操作。此外,非变性质谱分析中还要求使用不破坏生物大分子及其复合物的构象和组装状态的缓冲溶液和去溶剂条件。针对这些复杂基质生物样品质谱分析中面临的挑战,本论文论述了通过调控电离行为以提升电喷雾质谱分析性能的策略,发展了一系列面向单细胞质谱分析、生物大分子及其复合物的非变性质谱分析的离子化增强方法,实现了对复杂基质生物样品的免前处理质谱分析,为单细胞化学分析研究和气相结构生物学研究提供了新途径。在本研究论文中还包含了对电喷雾过程中核糖及核苷的区域选择性磷酸化反应的研究。主要内容如下:1.同步极化诱导电喷雾质谱及其在单细胞质谱分析中的应用在电喷雾离子化质谱中,酸性化合物适合使用负离子模式进行分析;反之,碱性化合物适合使用正离子模式进行分析。细胞在物质组成上具有多样性和复杂性,因此全面的单细胞质谱分析需要结合两种极性模式的质谱数据以提高单细胞样品的组分检出覆盖度。为此,我们发展了一种同步极化诱导电喷雾的敞开式离子化方法。该方法中,我们使用了交流方波电场诱导喷针内的溶液发生正、负两种极性模式交替进行的双极性喷雾,并通过同步切换质量分析器的极性模式与双极性喷雾过程匹配,实现了从皮升级的单细胞样品中同时采集包含正、负两种极性模式的质谱数据。得益于两种极性模式质谱数据的互补性,单细胞质谱分析的检测覆盖度得到了极大的提升:我们从单个PC-12细胞和单个洋葱外表皮细胞中分别鉴定到94种与86种组分。除此之外,相较于传统的纳升(典型值<100 nL min-1)电喷雾离子化,极化诱导电喷雾还具有喷雾流量低(～30 pL min-1)的特点,能显著延长单细胞样品的信号持续时间以完成串联质谱数据的采集,进而有利于单细胞样品中物质结构的准确鉴定。2.纳米毛细管电喷雾及其在抑制非特异金属加合物中的应用使用ESI-MS分析蛋白或者多肽样品时,常常受到基质效应的影响。特别是溶液中的非挥发性盐不仅会抑制样品的离子化,还容易与蛋白(多肽)发生非特异性加合,使得谱峰被分散,进而降低检测灵敏度。在本工作中,我们发现,与微米毛细管(典型值～1.2μm)电喷雾相比,纳米毛细管(典型值～120 nm)电喷雾能显著减少盐离子与蛋白(多肽)形成的非特异性加合物。这是因为喷针开口越小,形成初始液滴的尺寸也越小,液滴中盐离子的总数也成比例的减少,因此有利于减少盐离子对蛋白(多肽)的非特异性加合。除此之外,尺寸较小的初始液滴在形成气相离子的过程中,“溶剂蒸发和液滴碎裂”的次数较少,非挥发性盐的浓缩也较少,也有利于减少盐簇离子和加合离子的形成。纳米毛细管内溶液独特的理化性质(比如由带电玻璃内壁的“消耗-富集”效应造成的pH降低等)对盐离子加合行为的抑制也有所贡献。使用纳米毛细管能显著提高ESI-MS的基质耐受性,可以减少样品前处理(比如除盐)的步骤,并且操作简便、效果显著,为复杂基质条件下生物分子的质谱法检测和特异性分子间相互作用的质谱法研究提供了新手段。3.非特异性金属加合物在蛋白质两性离子状态研究中的应用基于质谱技术的气相结构生物学研究中要求生物大分子及其组装体在从溶液状态到气相的离子状态的转变过程中,尽可能维持其三维构象和组装状态。两性离子相互作用是蛋白中的一类弱相互作用力,指的是氨基酸残基上带有相反电荷的基团间的静电相互作用,对蛋白质及其复合物的构象和组装状态的维持十分重要。然而,在从溶液状态向气相离子状态的转变中,蛋白质的两性离子状态能否被保持仍然不清楚。该工作中,我们利用Na+与蛋白分子形成的加合物作为蛋白两性离子状态的标签,研究了 ESI中蛋白质两性离子状态的演变情况。结果表明使用低温(30℃以下)和低干燥气流量(典型值0.8Lmin-1)能有效避免盐离子加合物的形成,意味着蛋白质分子的两性离子状态能够在去溶剂化的过程中得以保持。此外,该去溶剂条件也提供了一种显著提升ESI-MS的基质耐受性的方法,可以实现高盐(如50mMNaCl)溶液中蛋白分子的直接检测和蛋白复合物结合状态的快速鉴定。4.电喷雾过程中核糖及核苷的区域选择性磷酸化的研究磷酸化反应是在生物体中最重要的有机反应之一,参与了各种生物分子的合成。核糖核苷酸是RNA的基本构成单元,其非生物的合成反应也被认为和生命的起源有关。本工作中,我们提出了核糖-5-磷酸及核糖核苷酸的两步法气相合成反应。该反应路线包括:首先通过使用负离子模式的电喷雾离子化产生核糖/核苷-焦磷酸盐的阴离子复合物;再通过碰撞激活促使复合物内发生磷酸基转移反应,生成磷酸化的产物离子。气相中的磷酸基转移反应对核糖/核苷中的伯羟基具有特异性,即生成5’磷酸化产物。在最优碰撞能量下,核糖-5-磷酸的产率为13.2%;四种构成核酸的基本结构单元:腺嘌呤核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸以及胞嘧啶核糖核苷酸的产率分别是18.9%、29.6%、17.6%和11.3%。