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目的:(1)建立鼠疫动物模型,并观察鼠疫F1IgM抗体的动态变化规律。(2)建立检测F1—IgM抗体的酶联免疫吸附试验(FI—IgM—ELISA)。(3)建立免疫胶体金标法检测人的F1—IgM抗体(FI—IgM—GICA)的方法。(4)对上述技术方法作出评价。
方法:(1)纯化鼠疫F1抗原,利用F1抗原、抗μ链抗体作为检测手段构成ELISA间接法。(2)用鼠疫F1单克隆IgM抗体为标准物,建立检测鼠F1 IgM抗体的酶联免疫吸附实验(ELISA)。(3)采用不同的两种免疫方式和三种的菌浓度免疫小鼠,用上述已建立的ELISA法检测免疫后的小鼠血清,筛选出免疫效果最佳的菌浓度。(4)再利用所筛选出的最佳菌浓度再次免疫小鼠,追踪观察每天鼠的特异性IgM抗体和IgG抗体出现的滴度和持续时间。(5)对ELISA的特异性的评价,选择鼠疫菌的近缘菌和与鼠疫产生相似的临床症状的致病菌与鼠疫菌同时平行免疫小鼠后进行检测,观察是否有交叉反应。(6)对ELISA敏感性的评价,采用统计学的分析方法计算敏感性。(7)对ELISA重复性和稳定性的评价,将鼠疫菌免疫小鼠后的鼠疫IgM阳性血清及鼠疫IgM抗体阴性的鼠血清各5份,在同一块板上重复加样5次(孔),测定其重复性。(8)选择阳性血清和阴性血清各1份在不同时间和不同板进行5次测定,观察其稳定性。(9)利用纯化的F1抗原、羊抗鼠抗μ链抗体(或羊抗人抗μ链抗体)构建胶体金免疫层析法检测鼠F1IgM早期抗体,并对GICA进行敏感性、特异性的实验室评价。(10)采集鼠疫频发地区(梁河)人血清标本,进行筛检,对免疫胶体金标层析法进行现场评价。
结果:(1)成功地纯化了鼠疫F1抗原。(2)用棋盘滴定法,选择出10μg/ml抗原包被浓度和1:15000酶标记二抗浓度,建立了间接ELISA法检测鼠源F1IgM抗体的方法。(3)鼠疫菌与近缘菌同时平行免疫小鼠后,用间接ELISA法检测,近缘菌结果为阴性,未见交叉反应。动物免疫后,获得70份小鼠血清进行检测,其敏感性是75%。重复性实验中,间接ELISA法的批次间的变异系数(CV)小于10%,稳定性实验中阳性血清的CV值=10.86%,阴性血清的CV值=12.46%。(4)胶体金免疫层析法检测鼠源的F1 IgM抗体方法的敏感性与间接ELISA法基本一致。特异性实验中,近缘菌结果为阴性,未见交叉反应。
结论:(1)在鼠疫感染早期能够检测到鼠疫特异性IgM抗体。(2)胶体金免疫层析法检测鼠源的F1 IgM抗体方法,其特异性、敏感性要高于ELISA法,可作为鼠疫早期诊断的常规方法。