草茹多糖的分离纯化、生物活性研究及结构分析

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草菇(Volvariella volvacea),又名稻草菇、兰花菇、中国蘑菇等,属担子菌纲、伞菌目、毒伞科、苞脚菇属,是世界上第三大栽培食用菌。糖类物质是草菇主要的营养成分,草菇多糖更是具有重要生理功能的活性物质。本文主要对草菇多糖的提纯工艺及生物活性进行了研究,初步分析了多糖结构并推测构效关系,研究结果如下:  1.对草菇多糖提取工艺进行了研究,主要探讨了热水提取法、微波辅助热水热水提取法和木瓜蛋白酶法工艺的优化。通过单因素和响应面优化实验,确定了热水提取草菇多糖的最优工艺条件:料液比1∶65(g/mL),79℃提取4.4h,反复提取1次,多糖得率为17.14%;通过单因素和正交实验,确定了微波辅助热水热水提取草菇多糖的最优工艺条件:微波功率400W,70℃微波20 min,80℃水浴继续提取4h,多糖平均得率为27.96%;通过单因素和均匀设计实验,确定了木瓜蛋白酶法提取草菇多糖的最优工艺条件:酶添加量0.2%,pH为6.5,62℃酶解2h,实际多糖得率为23.51%。对比三种提取方法的最高多糖得率,微波辅助热水提取法优于木瓜蛋白酶提取法优于热水提取法。  2.对草菇多糖分离纯化工艺进行了研究,主要探讨了Sevag法和中性蛋白酶-Sevag法对除蛋白的影响,活性炭法和H2O2法对脱色的影响。结果表明,中性蛋白酶-Sevag法除蛋白效果较佳,酶添加量40%,45℃酶解2h后,用Sevag试剂脱蛋白2次,蛋白脱除率为92.21%,多糖保留率为78.32%;H2O2法脱色效果较好,pH为9,H2O2添加量20%,60℃脱色3h,脱色率为99.45%,多糖保留率为69.12%。采用DEAE-52纤维素离子交换柱和Sephadex G-100凝胶色谱柱对草菇多糖进行分级纯化,得到VVP-1、VVP-2和VVP-3三个组分,紫外可见光谱扫描显示样品可能含蛋白。  3.对草菇多糖的生物活性进行了研究,主要探究了草菇多糖体外抗氧化能力、免疫调节活性及对抑制肝癌HepG2细胞增殖的影响。体外抗氧化实验结果表明,草菇多糖具有较弱的DPPH·自由基、O2-·自由基清除能力和还原能力,较强的.OH自由基清除能力。多糖样品清除DPPH·和·OH自由基活性顺序为VVP>VVP-1>VVP-2>VVP-3;多糖样品清除O2-·自由基及还原能力随着浓度变化而变化,在高浓度6mg/mL时,活性大小顺序为VVP-2>VVP-1>VVP-3。体外细胞实验表明,草菇多糖具有体外促进巨噬细胞和脾淋巴细胞增殖的作用,活性顺序为VVP>VVP-1>VVP-2>VVP-3;还具有体外抑制肝癌HepG2细胞增殖的效果,VVP-2较VVP-1、VVP-3表现出更强的活性。  4.对草菇多糖的结构进行了初步分析,主要通过SEM电镜扫描、薄层层析、GC-MS、IR扫描、高碘酸氧化、NMR等手段对多糖结构进行分析。电镜结果显示VVP呈海绵状,VVP-1呈光滑片状,VVP-2呈树枝状;单糖组成分析结果表明VVP-1和VVP-2均是由阿拉伯糖、木糖、果糖、半乳糖、葡萄糖及甘露糖组成;VVP-1和VVP-2的红外光谱图相似,两者均具有多糖的特征吸收峰,为吡喃糖化合物;高碘酸氧化结果表明,VVP-1和VVP-2中同时存在不同比例的1→6连接和1→2或1→4连接;13CNMR图谱结果说明VVP-1为同时含有α和β构型的吡喃糖,VVP-2为主要含有β构型的吡喃糖。
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