随着我国人民生活水平的提高和生活习惯的改变,AP的发病率日益升高。尽管在过去的几十年里,对于AP的诊治取得了重大进步,但SAP的死亡率依旧居高不下,仍在20-30%左右[1]。而SAP的发病原因复杂、可累及全身多个脏器的特点又加大了其治疗和研究的难度。根据大量研究结果显示,SAP常发生急性胃肠道损伤,造成肠道黏膜屏障功能障碍。肠道屏障主要由机械屏障、化学屏障、生物屏障和免疫屏障组成,正常情况下发挥阻隔肠道菌群及其有害产物进入血流和腹腔脏器的作用。当肠道屏障损伤时,肠黏膜通透性增加,肠道菌群便可穿过肠道屏障进入循环系统和腹腔组织器官,造成肠源性感染,这也是SAP患者后期死亡的主要原因。关于AP发生时肠道黏膜屏障功能障碍的发生机制有多种解释,但目前尚不完全清楚。Van等[2]人的动物实验也发现,在SAP条件下,肠道内存在革兰阳性球菌、革兰阴性杆菌和厌氧菌过度生长现象。这说明SAP中可能出现肠道菌群紊乱,破坏了原本稳定的微生物屏障结构,并影响到肠道屏障功能,促进了肠道菌群移位。若细菌产生的内毒素等产物入血,可刺激炎症细胞因子大量释放,加重全身炎症反应,并对胰腺造成“二次打击”,甚至引发或加重多器官功能衰竭,导致SAP患者死亡风险升高[3]。综上所述,我们推测肠道菌群变化可能参与了急性胰腺炎中的肠道黏膜屏障功能损伤和炎症反应,并对AP患者继发感染产生影响。为了验证上述研究假设,本研究特开展如下试验。一、目的检测AP患者肠道菌群的变化,研究肠道菌群对急性胰腺炎中肠道黏膜屏障和炎症反应的作用,以及肠道菌群对AP预后的影响。二、方法根据不同病情严重程度,对AP患者进行分组,主要分为重症急性胰腺炎组(SAP组,n=25)和轻症急性胰腺炎组(MAP组,n=37);重症急性胰腺炎组又可进一步细分为合并脏器衰竭的重症急性胰腺炎组(TSAP组,n=6)和中度重症急性胰腺炎组(MSAP组,n=19)。收集上述AP各个分组和健康人H组(n=31)的粪便、血清标本。对粪便标本细菌的16S r DNA V3-V4区采用高通量测序技术,检测肠道菌群多样性和丰度;对血清标本利用ELISA方法检测CRP、PCT和IL-6水平。此外,还收集急性胰腺炎患者临床资料,对病情进行评估,包括APACHE II评分和急性胃肠损伤(acute gastrointestinal injury,AGI)评分,以及随访患者有无继发感染等情况,对比不同分组检测结果,研究肠道菌群变化对炎症反应和肠道黏膜屏障的影响,以及肠道菌群对预后的影响。统计数据一律采用的是SPSS 18.0软件进行分析,其中将计量资料用均数±标准差(?x±SD)表示,而对组间比较采用的是t检验、单因素方差分析或非参数检验,相关性分析采用简单线性相关分析;分类资料用例数和百分比表示,组间比较采用Fishier确切概率检验或卡方检验;多因素分析采用logistic回归分析。三、结果(一)各组的CRP、PCT、IL-6水平和AGI分级比较1、各组的CRP、PCT、IL-6水平比较SAP组平均CRP水平为203.77±112.71 mg/L,PCT用中位数和四分位数表示为1.23(0.63,3.29)pm/m L,平均IL-6水平为74.25±78.04 pg/ml;MAP组平均CRP水平为103.50±62.14 mg/L,PCT水平为0.62(0.45,1.10)pm/m L,平均IL-6水平为32.15±27.88 pg/ml;H组平均CRP水平为5.88±3.86 mg/L,PCT水平为0.16(0.08,0.32)pm/m L,平均IL-6水平为4.89±3.52 pg/ml。根据单因素分析和t检验结果显示,和H组比较,SAP组和MAP组的CRP、PCT、IL-6水平明显升高,并且SAP组的CRP、PCT、IL-6水平升高比MAP组更为显著(P<0.05)。TSAP组的CRP水平为217.67±67.37 mg/L,平均PCT水平为8.05±9.87 pm/m L,平均IL-6水平为63.90±23.88 pg/ml;MSAP组的CRP水平为199.38±124.87 mg/L,平均PCT水平为1.31±1.25 pm/m L,平均IL-6水平为77.52±88.96 pg/ml。根据t检验结果显示,TSAP组与MSAP组的CRP和IL-6水平接近,差异无统计学意义(P=0.737和P=0.718),而TSAP组的PCT水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.001)。2、各组的AGI分级比较SAP组和MAP组两组患者全部发生肠功能障碍,AGI分级采用住院7天内最高的AGI分级。SAP组最低AGI分级最高为Ⅳ级,最低为II级,其中AGIⅣ级的为4%(n=1),AGIⅢ级的为20%(n=5),AGIⅡ级的为76%(n=19);MAP组AGI分级最高为Ⅱ级,最低为I级,其中AGIⅡ级为10.8%(n=4),AGIⅠ级为89.2%(n=33)。而H组的健康对照人群无肠功能障碍,AGI分级100%为0级(n=31)。根据Fisher确切概率检验,三组AGI分级差异有统计学意义,并且SAP组的AGI分级明显高于MAP组的AGI分级(P<0.001)。TSAP组AGIⅣ级的为16.7%(n=1),AGIⅢ级的为83.3%(n=5);而MSAP组AGIⅢ级的为100%(n=19)。根据Fisher确切概率检验结果显示,TSAP组和MSAP组的AGI分级差异有统计学意义,并且TSAP组的AGI分级要比MSAP组的高(P<0.001)。(二)急性胰腺炎中的肠道菌群变化分析根据单因素分析和t检验结果显示,SAP组、MAP组和H组的肠道细菌总量一致,差异没有统计学意义(P>0.05);但和H组比较,SAP组和MAP组肠道菌群丰度发生显著变化;而与MSAP组相比,TSAP组的肠道菌群也发生了部分优势菌的丰度变化。1、菌群多样性的比较根据Alpha多样性分析,SAP组、MAP组和H组的丰富度指数observed species指数、chao1指数和PD_whole_tree指数、多样性指数shannon指数和simpson指数并无显著差异(P>0.05),说明3组间的物种多样性无显著差异。2、菌群丰度的比较根据非参数检验结果显示,AP患者的肠道菌群丰度在各个分类水平上均发生了显著变化。在门水平上,拟杆菌门丰度下降、变形菌门丰度升高;在纲水平上,拟杆菌纲丰度下降、丙型变形菌纲丰度升高;在目水平上,拟杆菌目丰度下降、肠杆菌目丰度升高;在科水平上,拟杆菌科和毛螺菌科丰度下降,而肠杆菌科和肠球菌科丰度升高;在属水平上,拟杆菌属、罗氏菌属、萨特氏菌属和考拉杆菌属丰度明显下降,埃希菌属/志贺菌属、肠球菌属和乳酸杆菌属丰度明显升高。和MSAP组相比,TSAP组的埃希菌属/志贺菌属和萨特氏菌属丰度显著下降,差异具有统计学意义。(三)肠道菌群在急性胰腺炎中对炎症反应和肠道黏膜屏障的作用将肠道优势菌丰度与CRP、PCT和IL-6水平进行简单线性相关分析,结果显示不同分类水平的肠道菌群丰度与CRP、PCT和IL-6水平具有显著相关性。AP条件下,CRP、PCT和IL-6水平的升高和组间差异的形成,与拟杆菌、毛螺菌、罗氏菌、萨特氏菌和考拉杆菌等肠道细菌出现对应各个分类的丰度下降以及变形菌、肠杆菌、肠球菌在各个分类水平的丰度升高有关。综合以上研究结果,可知多种肠道菌群可能参与了AP中的炎症反应,并在其中起了抑制或促进炎症反应的不同作用。根据简单线性相关分析结果显示,不同分类水平的肠道菌群丰度与AGI分级具有相关关系。其中,拟杆菌、毛螺菌、罗氏菌、分类位置未定的毛螺菌、普氏菌和梭状菌等肠道细菌可能对肠黏膜具有保护作用,而变性杆菌、肠杆菌、埃希菌/志贺菌、假单胞菌等肠道细菌可能对肠黏膜具有损伤作用。这些肠道菌群极有可能在AP中参与肠功能障碍的发生和发展,并发挥着不同的作用。(四)肠道菌群和CRP、PCT、IL-6、AGI分级在预测SAP继发感染中的作用SAP组25人中共有6人发生胰腺坏死组织感染,其中TSAP组有5人发生感染,MSAP组有1人感染。对SAP组患者是否继发感染的可能影响因素进行logistic回归分析,这些因素包括:CRP、PCT和IL-6水平、AGI分级以及上述在不同研究对象分组中具有差异(P<0.05)、与炎症指标或AGI分级相关的优势菌等8个因素。结果显示只有PCT和AGI分级对SAP患者继发感染的影响具有统计学意义,AP分级越高,SAP患者继发感染的风险越高;而CRP、IL-6和肠道菌群对于SAP患者继发感染没有显著影响。四、结论肠道菌群变化可能参与了AP中的肠黏膜损伤和炎症反应,并与病情严重程度有关,但其优势菌的丰度水平与SAP患者继发感染的风险可能没有明显相关关系。