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研究背景：根据世界卫生组织(WHO)的《2012世界卫生统计报告》,缺血性心脏病已成为危害人类健康的“头号杀手”,冠心病(coronary heart disease, CHD)是其中的主要疾病。冠脉狭窄或闭塞后尽早恢复缺血区的血供是当前治疗心肌缺血性损伤的最有效手段,但大量研究表明,再灌注也可引起额外的细胞死亡,从而部分抵消冠脉恢复血供后对心脏产生的有利效应,故将这种缺血及再灌注造成的心肌组织损伤统称为心肌缺血／再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury, MIRI)。如何有效减轻MIRI,最大限度地减少心肌细胞丢失,已成为缺血性心脏病治疗中一项重要的研究课题。1986年Murry等首次报道了缺血预处理的机械性心肌保护措施,即预先进行多次短暂中断的缺血／再灌注循环,可明显减小心肌梗死面积,减轻缺血／再灌注损伤。之后,Zhao等发现了缺血心肌保护的另外一种方式：缺血后处理。但由于对预处理与后处理的实施次数、频率等都缺乏既定的标准,导致这些处理措施的临床应用受限。因此,阐明这些机械性调控对MIRI的保护机制,探寻特定的分子机制与作用靶点显得尤为重要。我们和其他课题组的研究发现,缺血预处理与后处理的心肌保护作用可能与促进激活低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的高表达有关。据此推测,如果直接给予或上调HIF-1α的表达也可能具有心肌保护效应,而目前未见这方面的相关报道。组织缺血缺氧时可启动一系列应答反应,其中HIF-1是一种关键性的转录因子,可调控近200个下游基因的转录激活来介导组织细胞对缺氧的适应性反应。HIF-1由受细胞氧浓度调节的α-亚基(120kDa)和组成性表达的p亚基(91-94kDa)共同构成。在常氧条件下,HIF-1能够被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroylase, PHD)羟化,进而被VHL (Von Hippel-Lindau)酶降解为泛素和蛋白酶体而失活；低氧时,PHD活性被抑制,使HIF-1二聚化并转位入细胞核,通过与靶基因启动子的低氧应答元件序列结合而转录激活多种蛋白的表达,从而参与机体的葡萄糖代谢、细胞增殖、新生血管生成等新陈代谢过程。然而,HIF-1α在心肌缺血／再灌注过程中是否具有心肌保护作用,如果有,其作用机制如何,目前均不清楚。由于目前无商品化的HIF-1α可购得,而内源性产生的HIF-1α在常氧条件下极易降解失活,故对HIF-1α进行研究时需要解决的首要问题是抑制其降解。二甲基乙二酰基甘氨酸(Dimethyloxalyglycine, DMOG),作为一种脯氨酸羟化酶抑制剂,在常氧状态下可稳定HIF-1α表达并抑制其降解,是目前较理想的HIF-1α活化剂。因此,本研究在大鼠心肌缺血/再灌注模型基础上,给予HIF-1α活化剂DMOG与抑制剂YC-1,观察调控HIF-1α的表达是否影响缺血/再灌注心肌组织的损伤程度,并探讨HIF-la作用的可能途径,从而为HIF-1α可作为防治心肌缺血/再灌注损伤的新靶点提供实验思路与理论依据。目的：1.明确上调HIF-1α表达对心肌缺血/再灌注损伤是否有保护作用；2.探讨HIF-1α发挥心肌保护作用的可能途径。方法：1.动物模型与实验分组：选取健康雄性Wistar大鼠,随机分为以下5组：(1)普通伪手术组(Sham, n=10):冠状动脉左前降支(LAD)只穿线不结扎；(2) HIF-1α活化剂+伪手术组(DMOG+Sham, n=10):缺血前24h腹腔注射HIF-1α活化剂DMOG(40mg/kg), LAD只穿线不结扎；(3)心肌缺血/再灌注组(MI/R, n=40):结扎LAD心肌缺血30min,松开结扎线分别再灌注0h,3h,6h,9h；(4) HIF-1α活化剂+心肌缺血/再灌注组(DMOG+MI/R, n=40):缺血前24h腹腔注射HIF-1α活化剂DMOG(40mg/kg),之后同(3)；(5) HIF-1α抑制剂+心肌缺血/再灌注组(YC-1+MI/R, n=40):缺血前30min经股静脉注射HIF-1α抑制剂YC-1(2mg/kg),之后同(3)。2.心肌组织HIF-1α表达量检测：RT-PCR法检测不同时间点大鼠心肌组织HIF-1α mRNA表达水平。3.心肌组织形态学检测：HE染色。4.心肌梗死面积测定：Evan’s blue与TTC双染法。5.血清心肌酶标志物含量检测：全自动生化分析仪速率法。6.细胞凋亡测定：采用TUNEL染色与Caspase-3活性检测。结果：1.大鼠心肌缺血/再灌注模型建立成功：结扎冠脉左前降支后,心电图Ⅱ导联显示ST段弓背抬高(≥0.15mV),再灌注时ST段逐渐回落到基线水平(图1),说明心肌MI/R模型建立成功。2. HIF-1α活化剂DMOG与HIF-1α抑制剂YC-1对心肌组织HIF-1α表达量的影响：Real-time PCR检测结果显示,单纯MI/R组的HIF-1α mRNA表达量在0-9h内呈逐渐降低的趋势,再灌注Oh时,MI/R组为Sham组的1.3倍(P<0.05)；HIF-1α活化剂DMOG明显上调HIF-1α的表达,而且在再灌注3h时达峰值,为MI/R组的2.1倍(P<0.05)；而HIF-1α抑制剂YC-l则使HIF-1α表达量在Oh,3h,6h,9h均低于MI/R组(P<0.05,图2)。因此,本研究选择再灌注3h时间点进行相关指标检测。3.心肌组织形态学检测结果：HE染色结果显示,与MI/R组相比,DMOG+MI/R组心肌纤维较完整,排列相对整齐,着色较均匀,间质水肿轻,炎性细胞浸润减少；而YC-1+MI/R组心肌纤维断裂,排列紊乱,心肌细胞明显坏死溶解,分限不清,炎症细胞浸润严重(图3)。4.心肌梗死面积测定结果：各组大鼠危险区面积占左心室面积的百分比(AAR/LV比值)无统计学差异(P>0.05),表明缺血/再灌注建模过程中各组缺血程度大致相当,排除了操作手法造成的误差。与Sham组相比,MI/R组心肌梗死面积明显增大[(48.76±2.50)%vs.(4.23+1.84)%,P<0.01],而HIF-1α活化剂DMOG则使心梗面积较MI/R组显著减小[(28.32±2.25)%凇.(48.76+2.50)%,P<0.05](见图4-1,2)。5.血清CK和LDH测定结果：单纯MI/R组的CK活性达0.85±0.15U/ml,明显高于Sham组的0.12+0.08U/ml(P<0.01)；而HIF-1α活化剂DMOG则部分逆转单纯MI/R所致的血清CK活性升高(降至0.46±0.03U/ml),与单纯MI/R组相比P<0.05；此外,HIF-1α活化剂也部分逆转单纯MI/R导致的血清LDH水平升高(0.98±0.11U/ml vs.2.17±0.16U/ml, P<0.05)(图5)。6.心肌细胞凋亡检测结果：TUNEL染色结果显示,单纯MI/R组心肌细胞凋亡指数为(8.23±2.45)%, HIF-1α活化剂DMOG使这一指标降至(2.68±0.84)%(P<0.01)；而HIF-1α抑制剂YC-1却使心肌细胞凋亡指数升高至(27.2+2.22)%,与单纯MI/R组相比P<0.01(图6)；单纯MI/R组心肌组织Caspase-3活性的OD值为0.19+0.03,明显高于Sham组的0.09±0.02(P<0.05),而HIF-α活化剂DMOG则部分逆转MI/R所致的Caspase-3的活性升高(OD值为0.11+0.01),与单纯MI/R组相比P<0.05(图7)。结论：利用DMOG上调HIF-1α的表达可明显减轻大鼠心肌缺血/再灌注的损伤程度,并且心肌细胞的凋亡数明显减少,提示HIF-1α的心肌保护作用可能与抑制心肌细胞凋亡有关。