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目的锌指蛋白703(zinc finger protein 703,ZNF703)是NET家族新近发现的成员,目前认为,ZNF703主要是通过负向调节转录、激活细胞周期相关转录基因发挥作用。本研究采用慢病毒转染技术干扰甲状腺乳头状癌K1细胞ZNF703信号的表达,通过检测ZNF703基因的表达水平,主要探讨ZNF703基因对K1细胞增殖、凋亡、侵袭的影响,为甲状腺癌的基因靶向治疗提供新的研究方向。方法1 RNA干扰技术下调ZNF703的表达筛选出最有效ZNF703-siRNA序列及K1细胞转染最适条件的摸索:甲状腺癌K1细胞分为5组:空白对照组、转染阴性载体对照组、转染阳性载体组,其中阳性载体组为设计合成的3对靶向人ZNF703基因的小干扰RNA(ZNF703-siRNA-1、ZNF703-siRNA-2、ZNF703-siRNA-3),采用表达绿色荧光的病毒载体转染体外甲状腺乳头状癌K1细胞,确定最适的病毒转染序列以及MOI值。慢病毒与细胞融合72h后荧光扫描显微镜下观测转染效率,采用Real-time PCR检测各组ZNF703 m RNA表达水平并筛选出最有效的siRNA。2 ZNF703基因沉默对甲状腺乳头状癌K1细胞蛋白表达水平的影响:K1细胞分组同前,采用免疫印迹法分别检测3组细胞目的蛋白表达水平。3ZNF703基因沉默对甲状腺乳头状癌K1细胞增殖、凋亡、侵袭能力的影响:分别应用MTT、流式细胞术、Hoechst 33342染色、Transwell侵袭实验检测空白对照组、阴性对照组、转染组K1细胞增殖、凋亡的情况及侵袭能力。4统计学分析:本研究中所有实验均平行重复3次。对符合正态分布的实验数值采用SPSS 17.0统计软件处理,对各实验数值进行组内和组间的单因素方差分析,结果以均数±标准差((?)±s)表示。检验水准设为ɑ=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义。结果1转染效率的优化及最优siRNA筛选:免疫荧光结果显示,在慢病毒转染中,分别以不同感染复数转染K1细胞时,以MOI=70时转染效率最佳,转染效率>80%。3条ZNF703-siRNA转染K1细胞72h后,ZNF703-siRNA-1、ZNF703-siRNA-2、ZNF703-siRNA-3 m RNA相对表达量分别为0.14±0.13、0.49±0.08、0.55±0.07(P<0.05),差异具有统计学意义(P<0.05),说明3条ZNF703-siRNA均发挥效应,尤以ZNF703-siRNA1沉默效果最佳,ZNF703-siRNA1组ZNF703 m RNA表达量较空白对照组下调了(81.60±2.03)%(P<0.05),差异具有统计学意义(P<0.05),后续相关实验均采用此条干扰序列。2 Western Blot检测蛋白的表达:转染48h后,转染组ZNF703蛋白相对表达量较空白对照组、阴性对照组显著下降,分别为[(0.295±0.015 vs 0.843±0.054、0.815±0.034)],差异具有统计学意义(P<0.05),空白对照组与转染阴性载体对照组之间无统计学意义(P>0.05)。3 MTT检测细胞增殖结果:分别于转染24h、48h、72h后行MTT检测,与对照组相比转染组24h开始出现生长抑制,并于转染48小时抑制效应最明显,达29.39%(P<0.05),空白对照组与转染阴性载体对照组之间无统计学意义(P>0.05)。4 FCM、Hochest 33342染色检测细胞凋亡结果:转染48小时后,FCM结果显示,转染组较空白对照组、阴性对照组凋亡率明显升高,凋亡率分别为(15.32±0.18)%、(5.97±0.16)%、(6.04±0.35)%(P<0.05);Hoechst 33342染色结果显示,转染组较空白对照组、阴性对照组凋亡率明显升高,凋亡率分别为(3.49±0.07)%、(4.84±0.19)%、(34.50±0.55)%(P<0.05),两种检测细胞凋亡结果具有一致性。5 Transwell检测细胞侵袭能力:与空白对照组、阴性对照组相比,转入ZNF703-siRNA的K1细胞侵袭数目显著下降,空白对照组、阴性对照组、转染组的穿膜细胞数分别为138.33±2.08、133.33±3.21、62.67±2.51(P<0.05),同时,转入空载体的阴性对组与空白对照组没有明显差异(P>0.05)。结论体外实验证实,通过慢病毒干扰技术,转染ZNF703-siRNA能显著下调甲状腺癌K1细胞ZNF703 m RNA的表达,对K1细胞的侵袭能力和增殖能力也有明显的抑制作用,并能显著提高细胞凋亡率,提示ZNF703-siRNA参与了甲状腺癌的发生发展进程。