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硝苯地平(Nifedipine,NIF)属于二氢吡啶类钙通道阻滞剂,临床上用于冠心病、高血压的治疗。自1984年第一例临床报道服用NIF并发牙龈增生以来,国内外学者普遍观察到牙龈增生(gingivalovergrowth,GO)为该药在口腔的重要的副作用。其病理特点表现为纤维组织增生并伴有不同程度炎性细胞浸润。许多学者在细胞水平和分子水平方面致力于对发病机制的研究,但目前发病机制仍不清楚。本研究通过体外原代培养正常的牙龈成纤维细胞(gingival fibroblast,GF)、NIF易感性和非易感性牙龈组织的成纤维细胞。通过细胞记数和噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法观察细胞增殖情况,酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测胶原表达的情况,初步探讨NIF诱导牙龈增生的可能机理。第一部分牙龈成纤维细胞原代培养【材料和方法】取阻生第三磨牙拔牙志愿者的健康牙龈组织,服用NIF导致牙龈增生患者的牙龈组织和服用NIF未表现牙龈增生患者的牙龈组织。通过组织块法体外原代培养成纤维细胞,第5～8代用于后续实验。【结果】组织块原代培养,10天左右有细胞游出。20～25天细胞铺满培养瓶底90%左右。原代细胞呈星形,传代稳定后,细胞伸展成长梭形,胞体丰满,胞核呈圆形,核仁清晰。免疫组化染色波形蛋白抗体阳性,胞浆棕黄色着色,阳性颗粒在胞浆中均匀分布。角蛋白抗体阴性。【结论】细胞培养是后续实验的基础,无菌规范的操作是原代培养成功率的保证。组织块原代培养GF是传统经典的培养方法,操作中的细节需要认真对待。第二部分硝苯地平对牙龈成纤维细胞胶原表达和细胞增殖的影响【材料和方法】适量NIF粉、无水乙醇和DMEM配置终浓度为108μg/L、360μg/L、1200μg/L的NIF液,无水乙醇的终浓度为0.01%。实验中使用健康GF。实验分组,第1组:含NIF 108μg/L;第2组:含NIF 360μg/L;第3组:含NIF 1200μg/L;第4组:空白对照,仅为标准培养液。分别于加药后1天、3天、5天,细胞计数观察细胞增殖,ELISA检测胶原表达情况。【结果】实验各组细胞在第1、3、5天内均增殖明显。第1、3天内各组之间增殖无明显差异,第5天各组中表现出显著性差异,差异出现在1200μg/L、360μg/L组与108μg/L组、空白组之间。胶原表达与细胞增殖结果相一致。第1、3、5天各组胶原表达都持续增加。第1、3天各组中表达无明显差异,第5天高浓度组1200μg/L、360μg/L较低浓度组108μg/L和空白组差异明显。【结论】体外研究表明1200μg/L、360μg/L浓度NIF比低浓度NIF有促进健康人GFⅠ型胶原表达和细胞增殖的作用,胶原表达增加和细胞增殖提高可能和药物性牙龈增生的机制有关。第三部分硝苯地平性牙龈增生组织中成纤维细胞增殖和胶原分泌【材料和方法】适量NIF粉、无水乙醇和DMEM配置终浓度为1μmol/L NIF液,无水乙醇的终浓度为0.01%。使用NIF易感性和非易感性牙龈组织的成纤维细胞。实验中细胞分为4组,分别为:GF-1、GF-2、GF-3、GF-4,其中GF-1、-2为NIF非易感性牙龈组织的成纤维细胞,GF-3、-4为NIF易感性牙龈组织中成纤维细胞。细胞接种于24孔板,于含1μmol/L NIF的DMEM中培养,分别于第1、3、5天后MTT比色法检测细胞增殖,ELISA检测胶原表达情况。【结果】NIF易感性牙龈组织中成纤维细胞在第1、3、5天均比非易感性组织中成纤维细胞增殖明显,都存在明显统计学差异。且NIF易感性牙龈组织GF-3与GF-4之间细胞增殖也存在统计学差异。同时NIF易感性牙龈组织比NIF非感性组织胶原表达明显增加,且存在统计学差异。相比GF-3与GF-4之间细胞增殖存在统计学差异,其胶原表达并未出现明显差异。【结论】体外实验结果显示NIF易感性牙龈组织和NIF非易感性牙龈组织在细胞增殖和胶原表达方面存在明显的差异。NIF易感性牙龈组织细胞增殖明显,同时胶原表达增加。这可能和NIF性药物牙龈增生的机制有关。