研究背景作为一种辅助治疗措施,极化液“葡萄糖-胰岛素-钾”(GIK)用于急性心肌梗死(AMI)和心脏外科手术的临床治疗已有50多年的历史,但其疗效一直存在争议。对这些临床试验的研究结果进行分析发现,GIK治疗组患者血糖显著升高可能是导致试验出现阴性结果的重要原因之一。我们实验室的研究发现,高血糖可加重大鼠和犬心肌缺血/再灌注损伤,且明显减弱GIK对缺血/再灌注心肌的保护作用。这些结果提示,良好的血糖控制是GIK临床应用的重要前提,但是高血糖减弱GIK心肌保护作用的机制尚不清楚。我们前期研究发现,胰岛素是GIK发挥心肌保护作用的关键成分;胰岛素可通过结合胰岛素受体(IR)促进胰岛素受体底物-1(IRS-1)酪氨酸磷酸化,激活3-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶B-内皮型一氧化氮合酶(PI3K-Akt-e NOS)途径抑制缺血/再灌注心肌细胞凋亡、促进心肌生存,防治迟发性心肌梗死。据此提出胰岛素直接激活细胞“生存信号(survival signal)”的细胞保护新机制。另一方面,近年的研究显示高血糖对细胞的损伤作用与葡萄糖的已糖胺生物合成通路(HBP)密切相关。尿嘧啶-5’-二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-Glc NAc)作为HBP的终产物,在O-连接N-乙酰葡萄糖胺(O-Glc NAc)糖基化转移酶(OGT)的作用下,导致蛋白质O-Glc NAc糖基化水平升高。然而,蛋白质O-Glc NAc糖基化修饰(O-Glc NAcylation)的作用位点往往是已知相同或相近的磷酸化位点,因此O-Glc NAc糖基化可通过竞争其修饰位点从而影响重要信号蛋白分子的磷酸化水平。那么,高血糖是否可通过O-Glc NAc糖基化修饰影响胰岛素“生存信号”中关键信号分子的活性,进而影响胰岛素对缺血/再灌注心肌的保护作用呢?因此,我们拟进一步研究高血糖减弱胰岛素对缺血/再灌注心肌保护作用的机制,尤其是O-Glc NAc糖基化修饰在其中的关键作用,期望对GIK及胰岛素在急性心肌梗死和心脏外科危重患者的临床应用中提供有价值的实验资料。研究目的1、探讨高血糖减弱胰岛素对缺血/再灌注心肌保护作用的机制,尤其是IRS-1和Akt的O-Glc NAc糖基化和磷酸化修饰在其中的关键作用。2、探讨心脏外科手术患者体外循环缺血/再灌注过程中血糖与GIK心肌保护作用的关系及其机制。研究方法1、利用酶消化法分离和培养原代乳鼠心肌细胞。稳定培养24h后乳鼠心肌细胞随机分为6组,分别给予以下处理:(1)对照组(Control);(2)Mannitol组(5.5 mmol/L葡萄糖+27.5 mmol/L甘露醇);(3)正常糖组(5.5 mmol/L葡萄糖,NG);(4)高糖组(33 mmol/L葡萄糖,HG);(5)NG+Ins(5.5 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L胰岛素);(6)HG+Ins(33 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L胰岛素)。分别作用48 h,后五组给予缺氧/复氧处理(置于95%N2、5%CO2细胞培养箱内缺氧4 h,95%O2、5%CO2细胞培养箱内复氧2 h)。2、采用谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺转移酶(GFAT)抑制剂6-重氮-5-氧代正亮氨酸(DON)对原代乳鼠心肌细胞进行处理,分组如下(1)NG+Ins(5.5 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L胰岛素);(2)HG+Ins(33 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L胰岛素);(3)HG+Ins+DON(33 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L胰岛素+40μmol/L DON),常规培养48 h后给予缺氧/复氧(4 h/2 h)处理。3、采用MTT测定法检测乳鼠心肌细胞存活率;收集细胞及其培养上清,检测乳酸脱氢酶(LDH)的活性以评估细胞损伤程度;采用Annexin V-FITC和PI双染的流式细胞术检测心肌细胞凋亡率。4、我们与西京医院心脏外科合作开展了二尖瓣置换手术患者体外循环围术期GIK治疗的随机对照临床研究,分别在麻醉诱导前给患者输注平衡盐溶液或GIK(200g/L glucose,66.7 U/L insulin and 80 mmol/L KCl),速度为60ml/h,时间持续12.5小时。5、分别于术前、体外循环5 min、主动脉阻闭5 min、主动脉开放5 min、术后1 h、术后6 h、术后12 h、术后24 h以及术后48 h采取血样,测定血糖浓度;检测患者术前及术后6 h、24 h、48 h的血浆肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(c Tn I)含量变化,用于评估心脏外科手术患者体外循环诱导的心肌损伤程度及不同组别对心肌损伤的影响。6、采用免疫沉淀法(IP)和Western Blot分别检测离体培养的心肌细胞及体外循环患者主动脉开放15 min后心肌组织中胰岛素信号分子IRS-1、Akt的O-Glc NAc糖基化和磷酸化水平。研究结果1、与正常葡萄糖培养组相比,高糖培养条件下心肌细胞的存活率显著降低,细胞凋亡和坏死增加(HG vs.NG,n=8,P﹤0.05)。与对照组相比,缺氧/复氧导致心肌细胞存活率降低,细胞凋亡和坏死增加;胰岛素干预可显著抑制缺氧/复氧心肌细胞凋亡、促进心肌细胞存活(NG+Ins vs.NG,n=8,P﹤0.05);而高糖存在情况下乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤进一步加重。不仅如此,高糖培养还可削弱胰岛素对心肌细胞的上述保护作用(HG+Ins vs.NG+Ins,n=8,P﹤0.01)。2、与正常糖培养组相比,高糖导致心肌细胞内蛋白质总O-Glc NAc糖基化水平及IRS-1 O-Glc NAc糖基化水平显著增加(HG vs.NG,n=4,P﹤0.01);在高糖存在时胰岛素处理组IRS-1的O-Glc NAc糖基化水平明显增加(HG+Ins vs.NG+Ins,P﹤0.01,n=4);与正常糖培养组相比,胰岛素干预导致IRS-1和Akt磷酸化水平增加(NG+Ins vs.NG,n=4,P﹤0.01);而高糖培养条件下,胰岛素诱导的IRS-1磷酸化水平降低45%,Akt磷酸化水平下降40%(HG+Ins vs.NG+Ins,n=4,P﹤0.01)。上述结果提示,高糖可增加胰岛素信号蛋白IRS-1的O-Glc NAc糖基化水平,同时降低胰岛素诱导的IRS-1、Akt的磷酸化水平。3、为进一步明确O-Glc NAc糖基化修饰在减弱胰岛素心肌保护效应中所发挥的作用,采用已糖胺生物合成通路的限速酶GFAT的抑制剂DON对心肌细胞进行预处理,结果显示:DON降低高糖诱导的IRS-1 O-Glc NAc糖基化水平,同时增加IRS-1、Akt的磷酸化水平(HG+Ins+DON vs.HG+Ins,n=4,P﹤0.05);阻断高糖对胰岛素心肌细胞保护作用的抑制效应,心肌细胞的存活率增加,心肌细胞凋亡与坏死减少(HG+Ins+DON vs.HG+Ins,n=8,P﹤0.05)。4、根据术中血糖水平,将患者分为以下四组:(1)对照组(输注平衡盐溶液,术中血糖<200mg/d L,Control-NG),n=7;(2)高血糖对照组(输注平衡盐溶液,但术中血糖≥200mg/d L,Control-HG),n=7;(3)GIK组(输注GIK,术中血糖<200mg/d L,GIK-NG),n=9;(4)高血糖GIK组(输注GIK溶液,但术中血糖≥200mg/d L,GIK-HG),n=11。与对照组相比,高血糖对照组血清中CK-MB、c Tn I释放量明显升高(Control-HG vs.Control-NG,P<0.01);与GIK组相比,高血糖GIK组血清中的CK-MB、c Tn I释放显著增加(GIK-HG vs.GIK-NG,P<0.01)。提示体外循环过程中高血糖加重心肌损伤,同时削弱GIK对缺血心肌的保护作用。5、与对照组相比,GIK治疗使患者心肌组织中IRS-1 Tyr Y608磷酸化水平和Akt Ser473磷酸化水平显著升高(GIK-NG vs.Control-NG,n=4,P<0.01);高血糖可诱导心肌组织内蛋白质的总O-Glc NAc糖基化修饰水平显著提高、IRS-1及Akt的O-Glc NAc糖基化修饰水平显著升高(Control-HG vs.Control-NG;n=4,P均<0.01);同时抑制GIK诱导的IRS-1 Tyr Y608磷酸化和Akt Ser 473磷酸化(GIK-HG vs.GIK-NG,n=4,P<0.01)。上述结果提示,GIK治疗可激活胰岛素“生存信号”,促进IRS-1及Akt的磷酸化;体外循环过程中出现的高血糖可导致IRS-1及Akt O-Glc NAc糖基化修饰水平增加,同时磷酸化水平降低,减弱GIK对胰岛素“生存信号”的激活作用。结论GIK通过促进IRS-1和Akt磷酸化,保护缺血/再灌注心肌细胞;高血糖可增加IRS-1和Akt的O-Glc NAc糖基化,进而降低IRS-1和Akt的磷酸化,从而减弱GIK/胰岛素对缺血/再灌注心肌的保护作用,良好的血糖控制是GIK充分发挥心肌保护作用的关键。