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伪狂犬病毒（Pseudo rabies virus,PRV）引起的猪伪狂犬病（PR）是我国严格控制和扑灭的二类动物疫病,目前尚无特效药,预防该病仍需疫苗接种。由自然缺失gE基因的Bartha-K61株制造的疫苗,广泛推广应用于猪场,效果稳定且良好,为PR的防控做出了巨大贡献。直至2011年末,经过经典疫苗株Bartha-K61免疫的猪场再次暴发PR疫情,表明经典疫苗株Bartha-K61已不能再为猪只提供完全的免疫保护。母猪繁殖障碍和新生仔猪死亡率不断增加,PRV gE抗体阳性检出率也在不断上升,给养猪行业带来了巨大经济损失。贵州省养猪生产实践中,我们也时常遇到已免疫Bartha-K61株的猪群发生PR疫病的情况。为了解此类疫病PRV毒株情况,为更好地解决养猪生产中的PR问题,本研究采用经典的病毒分离方法,从临床送检样品中分离获得了一株PRV变异毒株（GZYY2015）,并基于该毒株基因序列构建了gE基因缺失转移载体,为PRV变异株gE基因缺失疫苗的研究奠定了基础。1、PRV变异株GZYY 2015的分离鉴定本研究取2015年贵阳云岩区某泔水散养户送检的经实验室诊断为PRV阳性的组织病料样品,经匀浆、冻融和无菌滤器过滤后,取滤液接种至单层致密的Vero细胞,进行传代分离PRV毒株,并对其部分生物学特性进行了鉴定。实验结果表明,当盲传至6代后,PRV分离毒即可在Vero细胞上形成稳定CPE现象。电镜下可见病毒粒子在核内包涵体中呈现典型的晶格状排列,负染的病毒粒子呈圆形,正二十面体核衣壳结构明显,具有典型的PRV病毒粒子形态特征。测定其TCID50为10-9.13TCID50/0.1mL,一步生长曲线显示该病毒在12 h内处于潜隐期,12 h48 h病毒滴度上升较快,60 h病毒滴度达到最高值。将该毒株接种于家兔,可致其体温升高,注射部位奇痒。本研究对TK、gE、gD和gC基因进行T克隆,将克隆质粒和gB基因PCR产物送上海生工测序,结果显示,各基因大小及ORF依次为1535 bp（963 bp）、1752 bp（1740 bp）、1273 bp（1209 bp）、1651 bp（1464 bp）和2784 bp（2745bp）,与预期大小一致。序列相似性及遗传进化分析结果显示,TK、gE、gC、gB基因均和PRV变异流行株位于同一进化分支上,且具有较高相似性,而gD基因序列与Ea株完全相同,并与经典株位于同一进化分支上,这五个基因与国外PRV毒株均不在同一进化分支。通过对各基因的氨基酸序列进行比对分析,gE基因在第48、496位均有一个天冬氨酸（D）的插入,这两个位点的变异与国内PRV变异流行株变异位置相同,符合赵鸿远等人报道的PRV变异分子特征。该毒株gC、gB、gD、TK基因推导的氨基酸序列,存在不同程度的变异,变异位点及类型均与参与比较的变异毒株相似。2、PRV GZYY2015变异株gE基因缺失转移载体构建设计引物分别扩增PRV GZYY2015变异株gE上下游同源臂LA、RA,以及pEGFP-C1中绿色荧光蛋白表达相关基因序列。首先将扩增的gE左同源臂LA片段酶切后,克隆至pcDNA3.1真核表达载体中,构建pcDNA3.1-LA质粒。之后,再将扩增的gE右同源臂RA片段酶切后,克隆至pcDNA3.1-LA质粒载体中,构建pcDNA3.1-LA-RA质粒。最后将扩增的EGFP-C1片段通过酶切,克隆连接至pcDNA3.1-LA-RA质粒载体中,构建pcDNA3.1-LA-EGFP-RA质粒。测序结果表明,克隆的LA-EGFP-RA片段大小为3571 bp,两端分别为NheⅠ和XbaⅠ酶切位点,中间835 bp～2609 bp为EGFP序列,其两端均为Bam HⅠ酶切位点,测序结果与预期相符。