论文分为三部分。第一部分为DNA的纯化研究,先研究了硅藻土在质粒DNA纯化上的应用,系统研究了硅藻土各项指标对质粒DNA纯化的影响,最后将硅藻土纯化应用于果树基因组DNA提取和纯化;第二部分为应用PCR法从橙基因组文库筛选番茄红素β环化酶等位基因2(LCY-b2);第三部分为已筛选番茄红素β环化酶等位基因1(LCY-b1)的上游序列分析。研究取得了以下主要结果。 1.研究表明,沉降速度为6cm/min、1cm/min和0.25cm/min的硅藻土颗粒的DNA吸附能力约分别为0.009μg/mg、0.3μg/mg和2.5μg/mg。沉降速度为0.25—1cm/min的硅藻土颗粒可应用于DNA纯化。为吸附1μgλDNA,以加入20μl硅藻土悬浮液(约含10mg硅藻土颗粒)最为合适,回收率达77.31%。 2.应用改良硅藻土法纯化—长为14953bp的低拷贝质粒pLZ14,所得质粒纯度达23.87%,比未纯化前提高了11.06倍,经纯化的pLZ14质粒测序信号强、无误认碱基,而未经纯化的质粒测序时信号弱、错误普遍存在。应用硅藻土法我们成功去除脐橙果肉,多酚含量较高的多年生果树老叶中杂质,得到纯度和含量均较高的DNA。获得的DNA凝胶电泳条带清晰,无拖尾和明显滞留。 3.根据部分番茄红素D环化酶等位基因2(LCY-b2)设计特异引物,通过特异引物与通用引物配对筛选得到了仅在文库和基因组DNA上扩增的引物。该引物应用于文库筛选时发现,目标噬菌体稀释铺板后,PCR条带变弱,推测其繁殖能力明显弱于噬菌体文库的平均值,本研究通过多种方法优化筛选,提高目标噬菌体的繁殖能力,提高了目标噬菌体在筛选过程中出现的几率,为继续筛选打下了基础。 4.将已筛选的含番茄红素β环化酶等位基因1(LCY-b1)的噬菌体提取纯化后测序获得其上游区序列,应用启动子软件和数据库分析该序列,得到其理论上的启动子结合位点,为进一步的研究提供理论支持。