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宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤，是女性生殖系统第一大常见的恶性肿瘤，严重危害妇女的身心健康。早期和局部晚期的宫颈癌患者绝大部分以根治性手术和辅助性放化疗为主要治疗措施;晚期、复发宫颈癌的存活率并没有明显的改善，如何增强宫颈癌对放射化学治疗的敏感性，寻找治疗宫颈癌的新靶点，减少放射化学治疗后的复发和转移，改善存活率，具有重要意义。
第一部分 MELK在宫颈癌中的异常表达与临床病理特点的相关性研究
目的:本部分将探究母体胚胎亮氨酸拉链激酶(Maternal Embryonic Leucine Zipper Kinase，MELK)在正常宫颈组织，宫颈上皮内瘤变(Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN)，宫颈癌及配对癌旁组织中的差异表达，并回顾性分析各期宫颈癌的临床病理资料，探究MELK的表达与临床病理特点的相关性，以及与Ki67表达相关性。
方法:通过RT-qPCR和免疫组织化学实验分别检测MELK在宫颈癌组织和配对的癌旁组织中的表达情况，免疫组织化学检测MELK在从正常宫颈、CIN、宫颈癌不同临床标本组织中MELK的表达，以及相同样本的宫颈癌组织中MELK和Ki67表达的相关性;回顾性分析各期宫颈癌的临床病理资料探究MELK的表达与临床病理特点的相关性。
结果:1.MELK在从正常宫颈、CIN、宫颈癌的病程进展表达水平逐渐升高(P=0.001);2.MELK在宫颈癌中高表达率为56.92％(37/65);3.MELK在宫颈癌组织中的表达水平显著高于配对的癌旁组织;4.本研究中发现MELK的高表达情况与患者年龄(P=0.544)、血清鳞状上皮细胞相关抗原(P=0.668)、临床病理分期(P=0.456)、肿瘤侵犯深度(P=0.397)、以及病理组织类型(P=0.602)均无显著相关性;与早期无转移患者相比较，在宫颈癌早期转移阳性的患者中MELK的表达率更高(P=0.034);5.在MELK高表达的宫颈癌临床组织标本中，Ki67高表达的比例更高86.49％，在MELK低表达的宫颈癌组织标本中，Ki67高表达的比例相对较低50.00％(P=0.02)。
结论:MELK在宫颈癌中的表达水平显著高于配对的癌旁组织，MELK在从正常宫颈、CIN、宫颈癌的病程进展表达水平逐渐升高，MELK在宫颈癌中的异常表达，并对宫颈癌细胞增殖和转移等生物学行为产生影响。
第二部分 MELK在宫颈癌细胞中的功能学作用研究
目的:本部分检测了MELK在4种宫颈癌细胞系中的表达情况，通过检测MELK敲减后以及MELK抑制剂作用后，对宫颈癌细胞增殖，凋亡和克隆形成能力造成影响。
方法:通过生物信息学分析MELK在宫颈癌中的表达，RT-qPCR和Western Blot检测4种宫颈癌细胞系SiHa，HeLa，C33A和CasKi中MELK的表达水平;运用siRNA介导的RNAi技术体外敲减MELK的表达，Western Blot检测MELK siRNA的转染效率;通过CCK8和克隆形成实验分别检测siRNA敲减和抑制剂作用后各宫颈癌细胞系的增殖和克隆形成能力;运用Western Blot检测siRNA敲减和抑制剂作用后凋亡相关蛋白P53和Cleaved Caspase-3的表达情况。
结果:1.通过分析Oncomine微阵列基因表达数据集来确定MELK在宫颈癌组织和正常宫颈组织之间的mRNA差异表达，结果显示在宫颈癌组织中MELK的表达水平显着高于相应的正常宫颈组织(P＜0.001);2.细胞活性增殖实验表明转染MELKsiRNA后72h到120h，细胞的增殖被显著抑制，且随着时间的增加，这种抑制作用会越来越强;在抑制剂OTSSP167作用后72h到120h，细胞的增殖也被显著抑制，且随着时间与浓度的增加，这种抑制作用会越来越强;3.宫颈癌C33A和HeLa细胞经MELKsiRNA转染后其克隆形成能力明显下降，且不同浓度的抑制剂OTSSP167作用后克隆形成能力也明显下降，且随着抑制剂浓度的升高，克隆形成能力下降越显著，差异有统计学意义(P＜0.05);4.siRNA敲减后凋亡相关蛋白P53和Cleaved Caspase-3表达明显升高;使用不同浓度抑制剂OTSSP167作用宫颈癌细胞C33A，发现凋亡相关蛋白P53和Cleaved Caspase-3表达也明显升高，且在一定浓度范围内(0nM-5nM)，P53和Cleaved Caspase-3表达率随着抑制剂浓度的升高而升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论:MELK在4种宫颈癌细胞系中均有表达;MELK敲减和抑制剂OTSSP167作用后，能够抑制宫颈癌C33A、HeLa、CasKi和SiHa细胞的增殖;MELK敲减和抑制剂OTSSP167作用后，能够抑制宫颈癌C33A和HeLa细胞的克隆形成能力;MELK敲减和抑制剂OTSSP167作用后，能够促进宫颈癌C33A细胞的凋亡。
第三部分 MELK介导DNA损伤修复在宫颈癌细胞中分子机制研究
目的:本部分探究靶向MELK介导DNA损伤修复在宫颈癌中分子机制，首先在siRNA及抑制剂的作用下，DNA损伤修复蛋白γ-H2AX，p-ATM，p-CHK2等变化，后联合化疗药物顺铂，观察DNA损伤修复蛋白的变化，以及MELK在DNA损伤修复途径同源重组修复途径和非同源末端连接修复途径中的作用。
方法:通过CCK8法检测各组细胞对顺铂化疗的敏感性;运用Western Blot检测siRNA敲减后γ-H2AX、p-ATM和p-CHK2的表达;不同浓度抑制剂OTSSP167作用宫颈癌细胞C33A后，DNA损伤蛋白γ-H2AX的表达情况;通过免疫荧光实验技术检测，MELK敲低组的C33A和HeLa细胞核内γ-H2AX foci形成情况;Western Blot检测siRNA敲低联合DDP组细胞中DNA损伤蛋白γ-H2AX、P53、Cleaved Caspase-3、Rad50、Mre11和Ku70/80的表达。
结果:1.用CCK8法检测各组细胞对顺铂的敏感性，随着顺铂浓度的增加，siRNA敲减组的细胞增殖均受到了抑制，各组细胞对顺铂的半抑制浓度(IC50)具有明显差异;2.MELK siRNA敲减后宫颈癌细胞C33A中γ-H2AX的表达水平升高，抑制剂OTSSP167作用宫颈癌细胞C33A后，γ-H2AX表达水平逐渐升高，在0-10nM/ml浓度范围内，γ-H2AX的表达随抑制剂的浓度增加而增加;免疫荧光实验结果证实，相比较Ctrl siRNA转染组细胞而言，MELK敲低组的C33A和HeLa细胞核内有更多γ-H2AXfoci形成;3.Western Blot检测结果显示，与对照组相比较，MELK siRNA敲低联合DDP组细胞中DNA损伤断裂点标记蛋白γ-H2AX、细胞凋亡相关蛋白P53、Cleaved Caspase-3表达升高，差异有统计学意义(P＜0.05);4.宫颈癌细胞C33A分别转染Ctrl siRNA、siRNA＃1、siRNA＃2后进行检测，与对照组相比，MELK敲减组中的p-ATM和p-CHK2表达水平均有所升高，提示ATM-CHK2通路轻微激活提示MELK敲减导致复制应激产生;5.MELK siRNA联合DDP组细胞中的HR修复蛋白Rad50、Mre11表达水平明显低于DDP组，而NHEJ修复蛋白Ku70/80与MELK敲减联合化学治疗药物DDP作用无明显关联。
结论:下调MELK明显增强C33A细胞对DDP的敏感性，下调MELK能够造成宫颈癌细胞DNA损伤，MELK敲减能够诱导ATM/CHK2信号通路激活，MELK可能通过同源重组修复途径参与DNA损伤修复。
第一部分 MELK在宫颈癌中的异常表达与临床病理特点的相关性研究
目的:本部分将探究母体胚胎亮氨酸拉链激酶(Maternal Embryonic Leucine Zipper Kinase，MELK)在正常宫颈组织，宫颈上皮内瘤变(Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN)，宫颈癌及配对癌旁组织中的差异表达，并回顾性分析各期宫颈癌的临床病理资料，探究MELK的表达与临床病理特点的相关性，以及与Ki67表达相关性。
方法:通过RT-qPCR和免疫组织化学实验分别检测MELK在宫颈癌组织和配对的癌旁组织中的表达情况，免疫组织化学检测MELK在从正常宫颈、CIN、宫颈癌不同临床标本组织中MELK的表达，以及相同样本的宫颈癌组织中MELK和Ki67表达的相关性;回顾性分析各期宫颈癌的临床病理资料探究MELK的表达与临床病理特点的相关性。
结果:1.MELK在从正常宫颈、CIN、宫颈癌的病程进展表达水平逐渐升高(P=0.001);2.MELK在宫颈癌中高表达率为56.92％(37/65);3.MELK在宫颈癌组织中的表达水平显著高于配对的癌旁组织;4.本研究中发现MELK的高表达情况与患者年龄(P=0.544)、血清鳞状上皮细胞相关抗原(P=0.668)、临床病理分期(P=0.456)、肿瘤侵犯深度(P=0.397)、以及病理组织类型(P=0.602)均无显著相关性;与早期无转移患者相比较，在宫颈癌早期转移阳性的患者中MELK的表达率更高(P=0.034);5.在MELK高表达的宫颈癌临床组织标本中，Ki67高表达的比例更高86.49％，在MELK低表达的宫颈癌组织标本中，Ki67高表达的比例相对较低50.00％(P=0.02)。
结论:MELK在宫颈癌中的表达水平显著高于配对的癌旁组织，MELK在从正常宫颈、CIN、宫颈癌的病程进展表达水平逐渐升高，MELK在宫颈癌中的异常表达，并对宫颈癌细胞增殖和转移等生物学行为产生影响。
第二部分 MELK在宫颈癌细胞中的功能学作用研究
目的:本部分检测了MELK在4种宫颈癌细胞系中的表达情况，通过检测MELK敲减后以及MELK抑制剂作用后，对宫颈癌细胞增殖，凋亡和克隆形成能力造成影响。
方法:通过生物信息学分析MELK在宫颈癌中的表达，RT-qPCR和Western Blot检测4种宫颈癌细胞系SiHa，HeLa，C33A和CasKi中MELK的表达水平;运用siRNA介导的RNAi技术体外敲减MELK的表达，Western Blot检测MELK siRNA的转染效率;通过CCK8和克隆形成实验分别检测siRNA敲减和抑制剂作用后各宫颈癌细胞系的增殖和克隆形成能力;运用Western Blot检测siRNA敲减和抑制剂作用后凋亡相关蛋白P53和Cleaved Caspase-3的表达情况。
结果:1.通过分析Oncomine微阵列基因表达数据集来确定MELK在宫颈癌组织和正常宫颈组织之间的mRNA差异表达，结果显示在宫颈癌组织中MELK的表达水平显着高于相应的正常宫颈组织(P＜0.001);2.细胞活性增殖实验表明转染MELKsiRNA后72h到120h，细胞的增殖被显著抑制，且随着时间的增加，这种抑制作用会越来越强;在抑制剂OTSSP167作用后72h到120h，细胞的增殖也被显著抑制，且随着时间与浓度的增加，这种抑制作用会越来越强;3.宫颈癌C33A和HeLa细胞经MELKsiRNA转染后其克隆形成能力明显下降，且不同浓度的抑制剂OTSSP167作用后克隆形成能力也明显下降，且随着抑制剂浓度的升高，克隆形成能力下降越显著，差异有统计学意义(P＜0.05);4.siRNA敲减后凋亡相关蛋白P53和Cleaved Caspase-3表达明显升高;使用不同浓度抑制剂OTSSP167作用宫颈癌细胞C33A，发现凋亡相关蛋白P53和Cleaved Caspase-3表达也明显升高，且在一定浓度范围内(0nM-5nM)，P53和Cleaved Caspase-3表达率随着抑制剂浓度的升高而升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
结论:MELK在4种宫颈癌细胞系中均有表达;MELK敲减和抑制剂OTSSP167作用后，能够抑制宫颈癌C33A、HeLa、CasKi和SiHa细胞的增殖;MELK敲减和抑制剂OTSSP167作用后，能够抑制宫颈癌C33A和HeLa细胞的克隆形成能力;MELK敲减和抑制剂OTSSP167作用后，能够促进宫颈癌C33A细胞的凋亡。
第三部分 MELK介导DNA损伤修复在宫颈癌细胞中分子机制研究
目的:本部分探究靶向MELK介导DNA损伤修复在宫颈癌中分子机制，首先在siRNA及抑制剂的作用下，DNA损伤修复蛋白γ-H2AX，p-ATM，p-CHK2等变化，后联合化疗药物顺铂，观察DNA损伤修复蛋白的变化，以及MELK在DNA损伤修复途径同源重组修复途径和非同源末端连接修复途径中的作用。
方法:通过CCK8法检测各组细胞对顺铂化疗的敏感性;运用Western Blot检测siRNA敲减后γ-H2AX、p-ATM和p-CHK2的表达;不同浓度抑制剂OTSSP167作用宫颈癌细胞C33A后，DNA损伤蛋白γ-H2AX的表达情况;通过免疫荧光实验技术检测，MELK敲低组的C33A和HeLa细胞核内γ-H2AX foci形成情况;Western Blot检测siRNA敲低联合DDP组细胞中DNA损伤蛋白γ-H2AX、P53、Cleaved Caspase-3、Rad50、Mre11和Ku70/80的表达。
结果:1.用CCK8法检测各组细胞对顺铂的敏感性，随着顺铂浓度的增加，siRNA敲减组的细胞增殖均受到了抑制，各组细胞对顺铂的半抑制浓度(IC50)具有明显差异;2.MELK siRNA敲减后宫颈癌细胞C33A中γ-H2AX的表达水平升高，抑制剂OTSSP167作用宫颈癌细胞C33A后，γ-H2AX表达水平逐渐升高，在0-10nM/ml浓度范围内，γ-H2AX的表达随抑制剂的浓度增加而增加;免疫荧光实验结果证实，相比较Ctrl siRNA转染组细胞而言，MELK敲低组的C33A和HeLa细胞核内有更多γ-H2AXfoci形成;3.Western Blot检测结果显示，与对照组相比较，MELK siRNA敲低联合DDP组细胞中DNA损伤断裂点标记蛋白γ-H2AX、细胞凋亡相关蛋白P53、Cleaved Caspase-3表达升高，差异有统计学意义(P＜0.05);4.宫颈癌细胞C33A分别转染Ctrl siRNA、siRNA＃1、siRNA＃2后进行检测，与对照组相比，MELK敲减组中的p-ATM和p-CHK2表达水平均有所升高，提示ATM-CHK2通路轻微激活提示MELK敲减导致复制应激产生;5.MELK siRNA联合DDP组细胞中的HR修复蛋白Rad50、Mre11表达水平明显低于DDP组，而NHEJ修复蛋白Ku70/80与MELK敲减联合化学治疗药物DDP作用无明显关联。
结论:下调MELK明显增强C33A细胞对DDP的敏感性，下调MELK能够造成宫颈癌细胞DNA损伤，MELK敲减能够诱导ATM/CHK2信号通路激活，MELK可能通过同源重组修复途径参与DNA损伤修复。