【摘 要】
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近年国内外对白地霉的研究投入越来越多,白地霉脂肪酶作为未来极具潜力的生物催化剂其在芳香化合物的合成、环境治理、饲料蛋白、生物柴油、生物传感器食品加工及制药行业等方
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近年国内外对白地霉的研究投入越来越多,白地霉脂肪酶作为未来极具潜力的生物催化剂其在芳香化合物的合成、环境治理、饲料蛋白、生物柴油、生物传感器食品加工及制药行业等方面都有着巨大的潜能及开发价值。特别是在合成环十五内酯方面,由于目前使用的化学合成法存在工艺复杂、对设备要求高、污染环境、所得率低等问题,而用脂肪酶催化合成环十五内酯具有化学合成法无法比拟的优势,越来越多的人把目光转向于生物合成法。因此白地霉脂肪酶具有很大研究价值和商业价值。
本文从本实验室筛选出的脂肪酶高产菌株白地霉GXU08为出发菌株,提取了白地霉总DNA,克隆得到白地霉GXU08脂肪Ⅱ基因,分别构建了不同的大肠杆菌表达载体,并实现了白地霉基因在pET32a(+)中的表达。将不同的表达载体分别导入DH5α、BL21(DE3)及Rosetta,只有当载体选用pET32a(+)宿主菌选用Rosetta时,能成功表达,并在破胞后的上清中检测出酶活,用对硝基苯酚棕榈酸酯法测得酶活为17.8U/mL,SDS-PAGE检测到66kD的目的蛋白和预测的大小基本一致。利用金属镍亲和层析对表达产物进行纯化。
GeotrichumcandidumlipaseⅡ最适温度为40℃,Tm值为45℃在50℃的高温仍有适当酶活。最适pH为9,在抗金属离子方面K+、Ca2+离子对酶有一定的促进作用(103%-112%),Zn2+、Mg2+无明显抑制作用(98%-96%),Cu2+、Mn2+、Fe3+、Ni+有一定抑制作用(46%-88%)。Hg2+、Al3+明显抑制作用(1.4%-10%)。
用纯酶冷冻干燥后制得的酶粉,进行合成环十五内酯的反应,气相色谱测得有目的产物生成,但含量较低。白地霉脂肪酶作为真菌脂肪酶在国内仍处于实验室研究阶段,因此本实验为Geotrichumcandidum脂肪酶的商品化生产贡献一份力量。此外,该脂肪酶基因在大肠杆菌中实现成功表达,为白地霉的研究增添新内容,也为白地霉脂肪酶以后的研究及脂肪酶的工业化生产和生物法合成环十五内酯奠定了一定的基础。
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