研究背景射频消融(radiofrequency ablation, RFA)用于治疗肿瘤始于19世纪初,但近些年才引起人们的关注,被用于治疗包括肝脏、肾、甲状腺等部位的肿瘤。RFA作为一种新兴的肿瘤治疗方法,具有操作简便、微创、高效的优点。RFA是肿瘤热疗方法之一,RF电极针除传导性良好的暴露接触组织的针尖外,其余部分是绝缘的,它通常由超声或CT、MRI引导将RF电极针插入肿瘤中央。RF发动装置通过电极针向组织中施以交替的射频电流,使其周围组织内的极性分子和离子随电流方向变化而振动、摩擦,继而转化为热能,从而使局部组织细胞蛋白质发生不可逆的凝固性坏死。超声引导下消融是射频消融最常用的治疗方式。超声可以实时监测消融过程中电极针尖周围的强回声气化区变化来大致估计实际消融区域的范围。然而,目前对于该强回声范围能否代表实际消融范围尚存在不同观点。有报道认为射频消融过程中的强回声气化区能判断消融的范围；也有报道认为气化区时常形态不规则、分布不均匀,不能用于判断消融范围。射频消融的关键是将肿瘤组织凝固坏死的同时,尽可能减少周围正常组织的损伤。当肿瘤毗邻重要脏器(如胃肠、胆囊、大胆管、膈肌、喉返神经、颈动脉等)时,大范围的消融可导致严重并发症。因此,为了能在术中完全毁损肿瘤、避免损伤肿瘤两侧邻近的重要脏器,寻找一种良好的观察指标有着重要意义。多年来,微泡造影剂被用于肿瘤的超声诊断及射频消融术后的疗效随访,近年来微泡造影剂还被应用于肿瘤的治疗。近年来有研究发现超声微泡造影剂能增强高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound, HIFU)的消融效果,包括扩大消融范围和缩短消融时间。有研究进一步表明这一增强作用与微泡造影剂剂量有关,SonoVue的剂量越大,所引起的凝固性坏死的体积就越大。多数学者认为热机制是HIFU治疗肿瘤的主要机制。RFA与HIFU均同属于热消融治疗,无论体外或体内实验都提示微泡造影剂能增强HIFU治疗的热效应。然而,目前关于术中注射超声微泡造影剂同时进行射频消融能否会影响射频消融效果的研究尚未查到文献报道。目的本研究拟通过动物实验探讨超声微泡造影剂SonoVue对射频消融效果的影响,从二维灰阶超声、超声造影及病理学上了解消融灶大小的改变,分析消融时间的变化及强回声气化区形成,再进一步探讨该影响是否与微泡造影剂的剂量有关。在以上动物实验基础上将该方法应用于人甲状腺良性结节射频消融临床研究探讨其是否能成为一种有效的监测治疗手段。材料和方法一、研究对象①动物实验部分：健康新西兰大白兔52只,雌雄不限,体质量2.0-3.Okg,由南方医科大学附属南方医院实验动物中心提供。②临床实验部分：2012年4月至2012年12月在南方医科大学南方医院超声科接受甲状腺射频消融治疗,满足以下病例选择标准,同意参与该研究的患者。病例选择标准：术前结节穿刺病理诊断为良性实性甲状腺结节的患者,实验室检查甲状腺功能正常,术前超声提示结节为良性病变,且病变部位与周围组织无浸润,病变区无明显沙砾样钙化,颈部无淋巴结肿大,肿瘤最大径>1.Ocm,超声造影显示有造影剂灌注。患者共24例,男8例,女16例。年龄29-65岁,平均(50.67±11.76)岁。方案通过医院医学伦理委员会备案,所有患者均知情同意。二、微泡造影剂Bracco公司生产的注射用六氟化硫(SF6)微泡,(商品名声诺维：SonoVue),为冻干粉剂。每瓶含SF6气体59mg和冻干粉25mg,配制使用时,向瓶内注入生理盐水5ml并震荡20s,配制完成造影剂内微泡浓度在1-5×108个/ml,其中90%的微泡粒径小于8μm。三、射频与超声设备采用Philips iU22彩色多普勒超声诊断仪,L9-3型高频线阵探头,频率4.0-9.0MHz,于消融术前、术中、术后对目标治疗区进行二维灰阶超声及术后造影观察。采用Contrast general造影成像程序,实时双幅造影模式,机械指数(MI)为0.06。采用射频治疗仪Olympus Celon AG型(德国,Celon公司),脚踏启动,消融功率5W,与之匹配的电极CelonProBreath单针双极式消融针。射频针产生的温度在60-80℃之间,消融灶呈椭球形,长度约1.0cm,半径约0.3cm。消融过程中无需设定消融时间,系统利用消融区三维电阻反馈自动调控电流强度,达到额定热剂量后自动切断电路终止消融,系统蜂鸣器鸣响表示一次消融结束,避免了人为控制消融的误差。四、实验方法(1)动物实验：①实验分组：20只兔子用于研究超声微泡造影剂对射频消融影响,每只兔子肝上均进行两处消融,分为1组和2组,分别为微泡造影剂联合射频消融组和单纯射频消融组,超声造影剂注射量为0.05ml/kg。其余32只兔子用于研究不同剂量SonoVue对射频消融的影响,随机分为1、2、3、4组,每组8只,每只兔子肝上仅进行一处消融,第1组为RFA联合0.lml/kg SonoVue,第2组为RFA联合0.2ml/kg SonoVue,第3组为RFA联合0.3ml/kg SonoVue,第4组为单纯RFA组,即对照组。②射频消融：使用速眠新及戊巴比妥对新西兰大白兔先行肌注及静脉麻醉满意后,建立兔耳缘静脉用于补液和注射造影剂,每组中微泡造影剂以团注法经兔耳缘静脉体外注射通道注射,随后快速尾推lml生理盐水冲管,兔腹部消毒铺巾。选择较大的肝左叶进行射频消融,超声引导下将电极针插入肝内,避开大的管道结构及肝外邻近脏器。1组进行单纯射频消融,而2组在注射微泡造影剂肝脏显影同时进行射频消融。关于不同剂量SonoVue对射频消融的影响实验中,3组不同剂量微泡造影剂联合射频消融均为肝脏有微泡造影剂灌注时启动消融,对照组则进行单纯射频消融。系统蜂鸣器鸣响表示一次消融结束,射频仪自动停止工作,记录单针消融时间。常规二维灰阶显像模式下监视强回声气化区变化。术后进行超声造影评估消融灶大小。每只兔射频消融结束后即刻处死,开腹取出肝脏,将消融灶切出,测量消融灶大体标本的体积并进行常规HE染色光镜检查。(2)临床试验：24位病人随机分为两组,每位病人只选取一个实性结节入组,即每组12个结节,以每个结节第一针射频消融来实验,Ⅰ组接受单纯射频消融治疗,Ⅱ组接受超声微泡造影剂联合射频消融治疗。常规消毒铺巾后用1%利多卡因做皮肤、针道及结节周围浸润麻醉。穿刺点以尖刀片做1咖切口,切开皮肤及皮下组织,将射频针穿刺在结节的中心部位开启射频。超声微泡造影剂联合射频消融组于结节内开始有造影剂灌注时启动射频。常规二维灰阶显像模式下监测两组强回声气化区显示。系统蜂鸣器鸣响表示一次消融结束,射频仪自动停止工作,记录单针消融时间。五、统计学处理所有数据均采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料数据以均数±标准差(χ±s)表示,两组间均数比较采用完全随机设计资料的单向方差分析(One-Way ANOVA)。如存在方差分析显著情况,多个均数之间多重比较采用q检验。计数资料数据率的比较采用卡方检验。不同剂量组间强回声显示比较为多组等级／频数表资料的比较,采用完全随机设计多个样本比较的Kruskal-Wallis H检验。各组强回声气化区与消融灶体积间相关性分析采用线性回归检验。以P<0.05为差异有统计学意义。结果一、超声微泡造影剂对射频消融效果影响1组加入微泡造影剂后形成的强回声区形态呈稳定规则的椭圆形或类圆形,边界规则,分布均匀,同随后超声造影显示的消融灶形态更一致,超声造影显示两组消融均呈近椭圆形或类圆形的无造影剂灌注无回声充盈缺损；2组强回声形态不规则,边缘粗糙、模糊,缺乏稳定,较1组强回声区更难于识别。1组强回声区显示清楚的例数多于2组,1组显示强回声区的效果优于2组(P<0.05)。两组中强回声区大小与大体标本凝固灶大小经统计学分析均有线性相关关系,其中1组相关系数更高(r2=0.803)。两组在肝内靶区产生的消融灶体积从二维超声气化区体积、超声造影缺损区体积及大体标本体积上比较均无统计学意义(P>0.05)。在相同的消融功率下,两组单针消融持续时间结果显示,1组为(28.60±7.37)s,2组为(46.60±13.13)s,1组加入微泡造影剂后消融时间明显少于2组,两组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。病理学证实两组消融灶均为不可逆凝固性坏死。二、不同剂量超声微泡造影剂对射频消融效果的影响在相同的射频消融参数下,1、2、3、4组间强回声区、凝固性坏死体积均无统计学意义(P>0.05)。不同剂量微泡造影剂组间随造影剂剂量的增加,强回声区、凝固性坏死体积无明显变化。微泡造影剂组较单纯射频消融组间强回声气化区显示更清晰,然而不同剂量微泡造影剂组间随造影剂剂量增加,强回声气化区显示差异无统计学意义(P>0.05)。射频消融联合SonoVue组与单纯射频消融组间消融时间有显著性差异(P<0.001),然而多重比较结果显示除单纯射频消融组外,其余各不同剂量SonoVue组之间无显著性差异。病理检查：不同剂量微泡造影剂联合RFA治疗后,无论肉眼及光镜下均证实微泡造影剂联合RFA治疗后靶区肝组织发生不可逆坏死,各组间坏死组织形态特征无明显差别。三、超声微泡造影剂对人良性甲状腺实体结节射频消融影响Ⅱ组联合超声微泡造影剂进行消融形成的强回声区形态呈稳定规则的椭圆形或类圆形,边界规则,分布均匀,同随后超声造影显示的消融灶形态更一致,Ⅱ组强回声区更容易识别。Ⅰ组强回声形态不规则,边缘粗糙、模糊,缺乏稳定。Ⅱ组强回声区显示清晰的例数多于Ⅰ组,超声微泡造影剂联合射频消融产生的强回声区效果优于单纯射频消融(P=0.041)。在相同的消融功率下,两组单针消融持续时间结果显示,Ⅰ组为(39.50±11.80)s,Ⅱ组为(29.92±6.02)s,Ⅱ组联合微泡造影剂进行射频消融其消融时间明显少于Ⅰ组,两组间比较差异有统计学意义(P=-0.020)。结论1、微泡造影剂联合射频消融产生的强回声区可以清晰辨识,强回声区前缘及两侧缘的边界,形态稳定、规则,分布均匀,后缘受干扰较小,只有少数部分实验中存在后缘由于声衰减干扰而无法识别,为估测消融范围的一个良好指标。2、微泡造影剂联合射频消融与单纯射频消融均能使组织发生不可逆性损伤,产生的消融灶体积大小无明显差异。3、微泡造影剂联合射频消融使强回声区体积与凝固灶体积具有高度相关性,该强回声气化区更稳定、规则,优于单纯射频消融,通过观察该强回声区估测消融范围会更可靠。4、微泡造影剂联合射频消融缩短了单针射频消融时间,有望减少危险区域肿瘤的射频治疗时间。5、微泡造影剂联合射频消融增强射频消融效果的作用与微泡造影剂有关,然而尚无法证实该作用与微泡造影剂剂量相关。