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疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)由于具有热稳定性好、催化活性高、耐碱性等特点,在生物柴油、洗涤剂、食品、化妆品、皮革、医药和环境等领域作为工业催化剂应用广泛。然而,工业生产对脂肪酶的活性和耐受性有着极其严苛的要求,对TLL进行性质的优化能够克服其应用瓶颈,降低其生产成本。为了提高TLL的催化活性等性质,本研究利用计算机辅助设计和点饱和突变技术以及定点突变技术对TLL的催化活性及稳定性进行分子改造,产生的TLL突变体被证明具有良好的催化活性并且能够很好的应用到生物柴油工艺中。1.我们利用半理性设计,通过点饱和突变技术对TLL进行分子改造。选取TLL上的三个氨基酸位点(G23,D62,D96)进行三点饱和突变,完成了5760个突变体的筛选,得到12个酶活提高的的突变体。(1)通过分析突变体的性质,我们发现TLL的第96位氨基酸与其催化活性和酶学性质关系紧密,且G23,D62,D96这三个位点的复合突变可以获得酶学性质更加丰富的突变体。(2)且突变体G23A/D62K/D96H、D62R/D96E、D96Q、D96M、D96K、D62T/D96R的最适pH变为10.0;D62T/D96R、G23V/D96R、G23L/D62V的最适温度升高为60℃;G23T/D96R在80℃下处理45min,相对剩余酶活为47.3%,热稳定性较TLL有所提高;D96M、D96K的pH稳定区间较TLL变宽;D96M、D96K、G23L/D62V、G23V/D96R对底物的亲和力和催化效率均高于TLL。2.我们利用Rosetta软件的ddg_monomer模块进行单位点饱和突变计算,预测稳定性能够得到提高的TLL突变体。对预测结果进行总结、分析后我们发现TLL表面带电氨基酸极具影响TLL稳定性的潜力,因此我们对TLL带电氨基酸D111、D158、D165、R205、R209、R232、E239、D254位点进行定点突变。(1)结果发现4个带负电氨基酸D111、D158、D165和E239位点的突变能产生催化活性提高的突变体,并且相对应的生物柴油的转酯率有显著提高。结构学分析发现这4个带负电的氨基酸D111、D158、D165和E239远离活性中心,将其突变为其它氨基酸时TLL的表面静电势会受到影响,致使TLL产生性质丰富的脂肪酶突变体。其中,TLL突变体D165E的催化活性和热稳定性较野生型TLL均有提高,且对生物柴油的转酯率高达93.56%。(2)突变体D111E、D158F、D158H、D165E最适温度提高为60℃;D165A和R209D在80℃下处理45min,相对剩余酶活降为50%左右,其热稳定性较TLL有一定提高;D158H、D164E、R232E、E239R、D254R的pH稳定性提高;R232F、D165A、E239R对底物的亲和力和催化效率均高于TLL。综上,通过理性设计和半理性设计对TLL进行分子改造,我们获得了催化活性、热稳定性、生物柴油转化率均有所提高的TLL突变体,这些突变体有潜力成为工业界,尤其是生物质能源领域的新产品,同时,我们的分子改造方法也将为相关研究提供新思路。