植物离体器官再生是植物发育研究的一个重要方面,是指植物的组织或细胞团(愈伤组织)分化形成离体苗、根等器官的过程。目前,一些调控离体器官再生的基因已被挖掘,但有关离体器官再生的分子机理仍不清楚。初步的证据表明,表观遗传修饰在植物离体器官再生中亦起着重要作用,有关此方面的研究还很少,有待开展系统的研究。MicroRNA(miRNA)是一类小分子(～21核苷酸)非编码RNA,在基因的转录后调控方面起着重要的作用,是一种表观遗传修饰。大多数在生长发育中起重要作用的转录因子都是miRNA的靶标。功能涉及调控细胞分裂、分生组织分化、器官边界建立和叶片极性发育等方面,但其在体外培养细胞增殖和植株再生中的作用未见报道。本实验室通过对胚性与非胚性愈伤组织的基因表达谱分析发现,生长素受体TIR1和转录因子MYB96具有明显的差异表达模式,也可能参与了体外细胞增殖及离体苗再生,因此,二者在此方面的作用及其可能的机制值得深入研究。本研究利用已建立的拟南芥组织培养系统,拟开展拟南芥体外细胞增殖及离体苗再生的分子机制研究,为进一步揭示拟南芥细胞全能性的分子机理奠定了基础。主要进行了：1)拟南芥胚性与非胚性愈伤组织的miRNAs表达谱及其差异比较研究；参与细胞增殖及植株再生的候选miRNAs的筛选；候选miRNAs及其靶基因(ARF1O和TIR1)在细胞增殖和离体苗再生中的作用及可能机制研究。2)候选基因—MYB转录因子基因MYB96在细胞增殖和离体苗再生中的功能和作用机制研究,以期解析调控细胞增殖和离体苗再生的分子信号途径。另一方面,利用Col-0、MYB96过表达系和敲除系,开展了MYB96在拟南芥干旱胁迫下调控侧根发育的分子机制研究。主要的研究过程和实验结果如下：1.拟南芥miRNAs在体外离体苗再生和细胞增殖中的功能研究1.1胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的特征胚性愈伤组织在分化培养基上为黄绿色,含胚性细胞、胚性细胞团、不同发育阶段的胚状体及再生苗(C1型)；非胚性愈伤组织为浅绿色、粉粒状,细胞增殖速度快、不分化,仅含松散排列的不规则细胞(C2型)。1.2胚性愈伤组织(C1)和非胚性愈伤组织(C2)中miRNAs表达谱及其差异比较1) MiRNA芯片结果显示：15个miRNAs在C1和C2中差异表达明显,其中,5个在C1中高表达,分别是miR397、miR398、miR774、miR843和miR859；10个在C2中高表达,分别是miRl57、miR159、miR160、miRl65、miR166、miR167、miR319、miR390、miR393和miR394。2)茎环RT-PCR显示：C1和C2中miRNAs表达变化趋势与芯片结果完全一致。3) miRNAs靶基因的Real-time PCR和RT-PCR分析发现,多数候选miRNAs与其靶基因表达模式相反。1.3候选miRNAs表达模式分析1) Real-time PCR分析表明,候选miRNAs在离体根培养的愈伤组织形成、离体苗及根再生过程中的表达模式可以分为4类：(1)在SIM培养过程中,miR397a表达上调,miR160a、miR394a、miR393a和miR159b表达下调,表明它们可能参与了离体苗的再生；(2)在RIM培养过程中,miR159a、miRl65a、miR398、miR774和miR859表达上调,表明它们可能参与了离体根的再生；(3)在CIM诱导期间中,miR166a表达上调,表明其可能参与了细胞增殖；(4)在CIM预诱导过程中,miR157a、miRl66b和miR319a/b上调表达,表明它们可能参与了根外植体的脱分化过程。2)候选miRNAs在离体苗再生后期的表达模式：当SIM培养时间延长至20天时,C1中高表达的5个miRNAs:miR397、miR398、miR774、miR843和miR859都发生了明显的上调,其中,miR397a、miR859-774持续性高表达,miR398b/c和miR843在SIM培养后期高表达。3)组织特性表达分析发现,miR398a/b/c在茎和叶表达量高；miR397a/b、miR859-774在茎中高表达；miR843在茎顶端区域和茎中高表达。1.4 MiR160及其靶基因ARF10在离体苗再生中的作用及可能的分子机制1)对离体苗再生能力的影响对Col-0、35S::miR160a、35S::ARF10、mARF10(ARF10的miR160剪切抗性突变体)及arf10(敲除系)进行根外植体离体苗再生能力比较,结果表明,它们的离体苗数目分别为：35S::miR160a小于Col-0(1.2±L0.4<5.4±0.5)、35S::ARF10与Col-0相近(6.4±1.22≈5.6±1.14)、mARF10显著高于Col-0(22.3±3.98>5.8±1.3)、arf10低于Col-0(3.8±1.14<5.63±1.41)。表明过表达miR160a降低了根外植体离体苗的再生能力,而解除miR160对ARF10的剪切则能有效的提高离体苗再生能力。2)ARF10在离体苗再生过程中的表达模式GUS染色分析发现,ARF10在CIM上表达下调,在SIM上表达明显上调,尤其在SIM上培养14天后,特异性地表达在愈伤组织再生离体苗的部位表达,表明ARF1O可能参与了离体苗的再生。3)ARF10影响离体苗再生能力的可能机制(1)Real-time PCR分析发现,离体苗再生相关基因WUS、CLV3、CUC1/2表达水平在mARF10体内及其体外根培养物中最高,明显高于35S::miRl60a、35S::ARF10及Col-0。(2)组织学切片观察显示,在mARF10体内SAM部位,WUS及CLV3表达活性明显高于Col-0。(3)GUS染色分析发现,在mARF10根外植体中,WUS及CLV3表达高于且早于Col-0。表明,ARF10可能通过上调WUS及CLV3来提高mARF10离体苗的再生能力。综上所述,miR160a过表达降低了离体苗的再生能力,而ARF1O的自由表达则明显提高了这种能力,而且可能是通过上调WUS及CLV3表达来实现的。1.5候选miRNAs对体外细胞增殖的影响1)对部分miRNAs敲除系和过表达系进行了体外培养细胞增殖能力的比较,结果表明,men1(44%)、35S::miR160a和35S::miR159b(25%)茎顶端突起比率明显高于Col-0(16%)。2)GUS定位分析发现,miRl59b及miRl66b在根及茎顶端发生明显细胞增殖的部位表达。表明,它们可能参与了体外培养细胞的增殖。2.生长素受体基因TIR1对离体苗再生的作用及其可能的分子机制2.1 TIR1在体外培养条件下及植株体内的表达模式1)Real-time PCR分析表明,在SIM培养期间的TIR1表达水平明显提高,且这种上调依赖CIM的预诱导,否则会出现下降。2)GUS染色结果与上述Real-time PCR分析结果一致。在SIM诱导后期,TIR1特异性地定位在离体苗起始和再生的部位。3) Real-time PCR分析表明,TIR1在叶片中高表达,且随拟南芥发育时期的延长而逐渐下降。2.2 TIR1对离体苗再生和细胞增殖的影响1)对离体苗再生能力的影响：在35S::TIR1、Col-0、tir1-1中,每个根培养物再生的离体苗数目大小分别为：4.28±1.81>1.67±0.82>0.33±0.54；每个下胚轴培养物再生的离体苗数目大小分别为：7.5±0.8>6.7±0.65>2.3±0.33。表明,TIR1的过表达可能促进了离体苗的再生能力,而敲除该基因则严重降低了这种能力。2)延长CIM培养时间,无法恢复TIR1敲除引起的离体苗再生能力的降低。3)对细胞增殖的影响：CIM培养下,tir1-1根外植体由细胞增殖形成的突起数目和体积均小于Col-0和35S::TIR1。2.3 TIR1影响离体苗再生的可能机制1) Real-time PCR分析发现,细胞分裂素相关基因CDKB1、CKS1、IPT4、ARR15及体细胞胚发生相关基因LEC2、FUS3表达水平在35S::TIR1根培养物中明显上调,而ARR15、CKS1和LEC2在tir1-1中明显下调。2)LEC2和ARR15在离体苗再生中的表达模式类似于TIR1,表明TIR1可能通过调控上述基因的表达来影响离体苗再生的能力。3.拟南芥MYB96转录因子调控体外细胞增殖及离体苗的再生3.1 MYB96在愈伤组织形成及离体苗再生中的表达模式1) Real-time PCR分析表明,在SIM培养期间,MYB96表达发生特异性地下调,仅为CIM培养10天时的1/12,RIM培养10天的1/7。2)GUS染色分析发现,MYB96特异性表达在发生细胞增殖的部位；离体苗再生过程中,MYB96表达明显下降,仅在离体苗起始部位和后期形成的离体苗中。表明,MYB96可能参与了体外细胞增殖和离体苗再生。3.2对体外细胞增殖、离体苗及根再生的影响Col-0、myb96-1d(激活标签突变体,过表达系)、myb96-1(敲除系)进行体外培养发现,myb96-1d根外植体的细胞增殖速率、离体苗和根再生能力均小于Col-0和myb96-1,表明MYB96的过表达可能降低了细胞增殖、离体苗及根再生能力。3.3 MYB96影响体外细胞增殖、离体苗和根再生的可能机制1)对pCYCB1;1::GUS、myb96-1d×pCYCB1;1::GUS、DR5::GUS、myb96-1d×DR5::GUs、pSCR::GFP、myb96-1d×pSCR::GFP进行GUS染色和荧光观察分析发现,CYCB1:1、DR5及SCR的表达活性在myb96-1d体内及体外培养物中出现了一定程度的下降。2)半定量RT-PCR分析表明,在myb96-1d离体苗再生过程中,STM、WUS及CLV3的表达水平下降；在离体根再生过程中,PIN4表达水平下降。3)ChIP分析发现,MYB96直接与WUS、CLV3及PIN4的结合,表明,MYB96可能通过直接下调上述基因的表达,来降低myb96-1d离体苗及根再生能力。4.MYB96调控干旱胁迫下的侧根发育4.1 myb96-1d的表型分析与Col-0相比,myb96-1d表现出植株矮小,叶片卷曲,侧根数目明显减少。4.2 MYB96表达模式分析1)GFP亚细胞定位分析发现,MYB96定位在细胞核中。2)Real-time PCR分析表明,MYB96在拟南芥茎生叶、莲座叶和花中表达量最高,而在根中表达量最低。3)启动子GUS染色分析发现,MYB96在叶,茎及茎顶端分生组织中表达水平较高,并特异性地在侧根原基和叶片气孔的保卫细胞中高表达。4)非生物胁迫和激素处理下MYB96表达分析发现,MYB96受干旱胁迫和ABA的明显诱导,在一定程度上亦受IAA的诱导。4.3 MYB96调控ABA介导的拟南芥干旱胁迫耐受性1)抗旱性实验分析发现,myb96-1d干旱胁迫耐受力高于Col-0,而myb96-1对干旱胁迫非常敏感。干旱后重新浇水发现,90%的myb96-1d、45%的Col-0和15%的myb96-1重新恢复了生长。表明,MYB96可能参与调控了拟南芥对干旱胁迫的耐受力。2)功能回复系(pMYB96::MYB96 in myb96-1)能有效地恢复敲除系myb96-1对干旱胁迫耐受力降低的表型,表明,MYB96确实调控了对干旱胁迫的耐受性。3)气孔孔径大小比较发现,100μM ABA处理下,气孔孔径大小为,myb96-1d<Col-0<myb96-1,表明,MYB96可能通过减少气孔的开放程度来增强拟南芥的干旱耐受力。4) RT-PCR及Real-time PCR分析表明,RD22在myb96-1d中表达水平为Col-0的12倍,而在myb96-1中仅为Col-0的1/4。干旱胁迫下,RD22在myb96-1中受诱导程度明显下降。MYB96与RD22在aba3-1(ABA合成缺陷突变体)中,受干旱胁迫的诱导程度均明显降低。表明,MYB96是通过调控ABA依赖途径中的RD22来提高拟南芥对干旱胁迫的耐受力。4.4 MYB96调控侧根发育1)ABA对侧根发育的影响：在含0、0.5、1.0、2.0、3.0和5.0μM ABA的1/2MS培养基上的Col-0、myb96-1d、myb96-1根系发育比较分析发现,myb96-1d侧根数目明显少于Col-0和myb96-1,但主根生长不受影响。2)IAA处理pMYB96::GUS转基因植株的GUS活性分析发现,IAA能在根组织中特异性的诱导MYB96的上调表达。3)IAA对侧根发育的影响：在含0、1nM、10 nM、100 nM、1.0μM和10μMIAA的1/2MS培养基上的Col-0、myb96-1d和myb96-1侧根发育比较发现,IAA无法恢复MYB96高表达引起的侧根数目减少的表型。4)可能的分子机制：(1)RT-PCR及Realtime-PCR分析发现,GH3.3、GH3.5/WES1、GH3.6/DFL1及生长素相应因子基因ARF17表达水平在myb96-1d中明显高于Col-0和myb96-1,这些基因被报道与侧根发生和发育相关。表明,MYB96可能通过上调上述基因表达来减少拟南芥的侧根数目。(2) Real-time PCR分析发现,ABA能诱导GH3.3、GH3.5/WES1、GH3.6/DFL1的上调表达,表明,MYB96调节的ABA信号通过上调GH3基因表达来调控干旱胁迫下的侧根发育。