目的:乳腺癌是发病率最高的女性常见恶性肿瘤。近年来全世界范围内,乳腺癌的发病率都在逐年递增,严重威胁妇女的生命健康。尽管目前针对乳腺癌的诊疗措施有了实质性的进展,但乳腺癌的死亡率仍位于女性恶性肿瘤之首,乳腺癌转移已成为乳腺癌患者死亡的主要原因,超过90%的乳腺癌患者死于乳腺癌的转移。乳腺癌远隔转移造成了患者严重的不良预后,乳腺癌患者的5年生存率经统计,未发生转移的高达98%,而发生转移的患者急剧下降低至23%。目前乳腺癌转移的分子机制仍然是科研人员研究的重要课题,因此对其进行更深入的探索将为乳腺癌的诊疗提供一定的理论依据。P21蛋白活化激酶(P21-activated kinase,PAK)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶,它在进化中保守,作为Cdc42/Rac1、生长因子信号下游的主要靶蛋白,它的活化依赖于生长因子和其他细胞外信号。PAK通过结合下游靶蛋白或生理性底物,参与到众多生物学功能,例如细胞极性、细胞运动、细胞骨架重组、细胞周期演进、基因转录调控等,尤其是在细胞转化和肿瘤进程中具有重要作用。目前,PAK家族一共发现并证实有6个成员,根据结构可分为两类,Ⅰ类成员有PAK1-3,Ⅱ类成员有PAK4-6。其中,PAK5是最新发现的Ⅱ类PAK家族成员。目前有关PAK5的研究表明,PAK5在脑和多种肿瘤组织中呈高表达或具有高活性,定位于细胞内的线粒体,与神经生长、细胞骨架、细胞存活等信号通路密切相关。PAK5能阻滞细胞周期,抑制细胞凋亡,促进肿瘤生长,但PAK5在肿瘤侵袭转移方面的研究甚少。本实验室的前期研究发现,PAK5在乳腺癌组织中高表达,引起乳腺癌细胞的形态发生变化,它可以下调E-cadherin的表达,上调Fibronectin、Vimentin的表达,进而促进乳腺癌的侵袭转移。因此,我们推测PAK5可能在乳腺癌的发生发展中起到了重要的作用。为进一步探讨PAK5在乳腺癌进程中所发挥的作用,我们采用蛋白质免疫共沉淀技术富集乳腺癌MCF-7细胞中的PAK5结合蛋白,并联合蛋白质质谱分析技术,得到相应的肽序列标签,筛选出PAK5在乳腺癌细胞MCF-7中的相互作用蛋白。DNPEP(aspartyl aminopeptidase)是通过蛋白质免疫共沉淀结合蛋白质质谱技术筛选出的PAK5新的互作蛋白。DNPEP是一种氨肽酶,是M18家族唯一的哺乳类成员,氨肽酶是调节信号肽活性的关键酶,它普遍存在于生命的一切形式中,并在与信号肽相关的大量生理过程中起到重要作用,如血管生成、血压的维持、记忆、肿瘤生长和转移等。它在进化中高度保守,并在哺乳动物中高表达。但DNPEP的生理功能与调控机制,尤其是其在肿瘤演进过程中的作用尚不完全清晰。本研究在蛋白质相互作用的基础上,探讨了PAK5与DNPEP之间的调控机制,以及该通路在乳腺癌细胞增殖和转移的作用,为进一步探寻乳腺癌进程的分子机制提供理论依据。方法:一、PAK5对DNPEP磷酸化位点的筛选及其相互作用的证实。1、GST-pull down实验鉴定PAK5与DNPEP在体外的相互作用。2、蛋白质免疫共沉淀实验确定PAK5与DNPEP在细胞内的相互作用。3、体外激酶分析实验检测PAK5对DNPEP的磷酸化情况。4、体外激酶分析实验检测PAK5对DNPEP磷酸化的具体位点。5、构建真核表达质粒3×Flag-DNPEP SA,模拟DNPEP的激酶死型。6、Western Blot检测乳腺癌细胞中PAK5对DNPEP的磷酸化作用。二、PAK5介导DNPEP的磷酸化对乳腺癌细胞的增殖和转移的影响。1、克隆形成实验检测过表达CON,DNPEP WT,DNPEP SA对乳腺癌细胞增殖能力的影响。2、划痕实验检测过表达CON,DNPEP WT,DNPEP SA对乳腺癌细胞迁移能力的影响。3、Transwell实验检测过表达CON,DNPEP WT,DNPEP SA对乳腺癌细胞迁移侵袭能力的影响。4、利用裸鼠成瘤实验观察分析磷酸化的DNPEP对乳腺癌细胞增殖、转移能力的影响。三、USP4为PAK5-DNPEP通路的下游底物。1、蛋白质芯片技术筛选出DNPEP的相互作用蛋白。2、过表达DNPEP,Western Blot检测USP4的蛋白表达情况。3、蛋白质免疫共沉淀实验确定DNPEP与USP4在细胞内的相互作用。4、过表达不同磷酸化状态的DNPEP质粒,Western Blot检测USP4蛋白的表达。四、PAK5可促进DNPEP的降解。1、Western blot检测PAK5、DNPEP和USP4在乳腺癌组织样本中的表达,并分析它们在癌旁和癌组织中的表达情况。2、过表达PAK5,Western Blot检测DNPEP和USP4的蛋白表达情况。3、CHX处理,同时过表达PAK5,Western Blot检测PAK5对DNPEP蛋白表达的影响。4、MG132处理,同时过表达PAK5,Western Blot检测PAK5对DNPEP蛋白表达的影响。5、MG132处理,同时过表达PAK5和不同磷酸化状态的DNPEP质粒,IP实验检测DNPEP的泛素化水平。五、PAK5与USP4的高表达可以促进乳腺癌的转移。1、免疫组化实验检测PAK5和USP4在乳腺癌组织样本中的表达,并分析它们表达的相关性,以及与乳腺癌转移的关系。2、对PAK5、USP4不同表达水平的乳腺癌病例进行生存分析。六、DNPEP与CD44相互作用并调节CD44的表达。1、Western blot检测DNPEP和CD44在乳腺癌组织样本中的表达,并分析它们在癌旁和癌组织中的表达情况,以及它们表达的相关性。2、蛋白质免疫共沉淀实验证实DNPEP与CD44在细胞内存在相互作用。3、共聚焦激光显微镜实验证实DNPEP与CD44在细胞内存在共定位。4、过表达DNPEP,Western blot检测CD44的蛋白表达情况。5、敲减DNPEP,Western blot检测CD44的蛋白表达情况。七、DNPEP可水解CD44,并参与乳腺癌干细胞特性的调节。1、CHX处理,同时过表达DNPEP,Western Blot检测DNPEP对CD44蛋白表达的影响。2、MG132处理,同时过表达DNPEP,Western Blot检测DNPEP对CD44蛋白表达的影响。3、过表达水解酶活性状态的DNPEP质粒,Western Blot检测CD44的蛋白表达情况。4、L-DOPS处理,同时过表达DNPEP WT质粒,Western Blot检测CD44蛋白的表达。5、过表达DNPEP,Western Blot检测干细胞特性相关指标的蛋白表达情况。6、微球体形成实验检测过表达DNPEP对乳腺癌细胞干细胞特性的影响。结果:一、PAK5与DNPEP在体内外存在相互作用,PAK5磷酸化DNPEP的S119位点。1、PAK5与DNPEP在体外存在直接的相互作用。2、PAK5与DNPEP在细胞内存在相互作用。3、体外激酶实验确定PAK5可以磷酸化DNPEP的S119位点。二、磷酸化的DNPEP抑制乳腺癌细胞的增殖和转移。1、磷酸化的DNPEP可抑制乳腺癌细胞的增殖能力。2、磷酸化的DNPEP可抑制乳腺癌细胞的转移能力。三、USP4为PAK5-DNPEP轴下游的底物。1、蛋白质芯片技术筛选出DNPEP的互作蛋白USP4。2、USP4与DNPEP在细胞内存在相互作用。3、过表达DNPEP,可下调USP4的表达。四、PAK5可促进DNPEP的降解。1、PAK5与USP4在乳腺癌组织中高表达。2、DNPEP在乳腺癌组织中低表达。3、过表达PAK5,可下调DNPEP蛋白的表达,上调USP4蛋白的表达。4、PAK5介导DNPEP的磷酸化可以促进DNPEP蛋白的泛素化降解。五、PAK5与USP4的高表达可以促进乳腺癌的转移。1、发生远处转移的肿瘤组织中PAK5与USP4均呈高表达。2、在乳腺癌组织中,PAK5与USP4的表达呈正相关。3、PAK5与USP4高表达的患者,生存时间更短。六、DNPEP可水解CD44,并抑制乳腺癌细胞的干细胞特性。1、乳腺癌组织中CD44高表达,与DNPEP呈负相关。2、CD44与DNPEP在细胞内存在相互作用。3、CD44与DNPEP在细胞内存在共定位。4、DNPEP可通过水解作用下调CD44的表达。5、DNPEP对乳腺癌细胞的干细胞特性有抑制作用。结论:1、DNPEP是PAK5的生理性底物。2、磷酸化的DNPEP可抑制乳腺癌细胞的增殖和转移。3、USP4为PAK5-DNPEP通路下游的底物。4、PAK5介导DNPEP的磷酸化可以促进DNPEP的泛素化降解。5、PAK5与USP4的高表达可以促进乳腺癌的转移。6、乳腺癌组织中PAK5与USP4的表达呈正相关。7、高表达PAK5与USP4的患者,生存时间更短。8、乳腺癌组织中CD44与DNPEP的表达呈负相关。9、CD44为DNPEP的水解底物。10、DNPEP可抑制乳腺癌细胞的干细胞特性。