低温蛋白酶作用温度越低，催化效率越高，使其在工业和生活上得到了广泛的应用。但由于热不稳定性等限制条件，使得低温蛋白酶在应用方面受到了诸多限制。因此，越来越多的研究者们利用分子生物学技术及基因克隆等手段，通过异源表达来提高低温蛋白酶的产量，为低温蛋白酶的应用奠定了基础。本实验室筛选出来一株高产低温蛋白酶的耐冷菌Pseudomonas sp.W7，经过前期酶学性质分析发现，该菌株所产的低温蛋白酶在35℃时拥有较高酶活，可达193.2U·mL-1。且温度超过40℃后，酶活力急剧下降。本实验采用了两种途径克隆耐冷菌Pseudomonas sp.W7所产低温蛋白酶的基因序列。耐冷菌Pseudomonassp.W7经前期鉴定，确定属于假单胞菌属，我们首先依据NCBI数据库中假单胞菌属所产的胞外低温蛋白酶的同源保守区域序列设计引物，以耐冷菌Pseudomonassp.W7基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得低温蛋白酶的基因序列。另外，我们还从Pseudomonas sp.W7所产低温蛋白酶出发，通过质谱分析获得了该酶匹配肽段氨基酸序列，并依此设计引物克隆到耐冷菌Pseudomonas sp.W7所产低温蛋白酶的基因序列。我们将对两种方式得到的基因序列进行比对并进行了生物信息学分析。利用假单胞菌属所产的胞外低温蛋白酶的同源保守序列设计引物，以耐冷菌Pseudomonas sp.W7基因组DNA为模板，PCR扩增出5’端长度为1238bp的序列和3’端长度为652bp的序列，拼接后找出完整的开放阅读框，其全长1719bp。该序列编码573个氨基酸，理论分子量为63639Da。通过NCBI比对发现该序列和Pseudomonas fluorescens A506所产的C13家族的肽酶的同源性高达到99%。，而且由氨基酸的组成成分来看，该序列脯氨酸的含量低而甘氨酸的含量高，且丝氨酸、缬氨酸等小分子量氨基酸的含量也很高，这说明该蛋白序列符合低温酶的低温特性。通过生物信息学的分析，该序列上还含有4个N-糖基化位点，N端还有19个氨基酸残基的碎片，二级结构中α螺旋占22.95%，β折叠占19.01%。在15℃、20℃和25℃下分别培养耐冷菌Pseudomonas sp.W7，对发酵液上清进行酶谱分析发现，该菌株在15℃下只产一种低温蛋白酶P1，酶活力为62.6U·mL^-1，而在20℃和25℃下产两种低温蛋白酶P1和P2，酶活力为193.2U·mL^-1和134.0U·mL^-1。我们选择了酶活力较高的蛋白酶P2条带进行质谱鉴定，质谱结果由MASCOT检索比对得知，没有找到与低温蛋白酶完全匹配的蛋白，匹配率最高的蛋白的分数为84，推测该低温蛋白酶是一种新蛋白。与低温蛋白酶匹配度最高的蛋白为原肠胚锌指蛋白（RecName: Full=Gastrula zinc finger proteinXlCGF28.1）。该蛋白由252个氨基酸组成，其中与目的蛋白酶有12个肽段匹配。利用匹配的肽段设计引物，以耐冷菌Pseudomonas sp.W7基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得了长为1798bp的序列，分析后发现其中含有1238bp的5’端序列。同理设计引物，PCR扩增出3’端长为678bp的序列，将两段序列拼接并通过PCR验证得到完整的ORF，全长为1737bp的序列。该序列编码578个氨基酸，理论分子量为63821Da。对以上序列在NCBI中进行同源性比对分析发现，该序列与原肠胚锌指蛋白的同源性只有43%，结合质谱分析结果推测该低温蛋白酶是一种新蛋白。分析该序列的氨基酸组成发现，序列中甘氨酸含量很高，且一些小分子量氨基酸的含量也很高。这说明此蛋白序列具有低温酶的低温特性。通过生物信息学分析发现，该序列含有3个N-糖基化位点，但不含有信号肽序列，在二级结构中α螺旋占32.01%，β转角占7.44%。通过两种方法获得的两条低温蛋白酶基因序列经过比对，它们的同源性仅为15.03%，说明这完全是两条不同的蛋白，只是由于分子量相差很小，因此酶谱分析中并没有显示。结合生物信息学的分析及获得基因序列来看，初步推测耐冷菌Pseudomonas sp.W7至少产两种低温蛋白酶，需要后续的功能验证来确认。