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抗原检测在微生物感染和重大疾病的诊断、疾病进展的监测、药物疗效观察和耐药性监测以及食品卫生等领域中至关重要。荧光标记、酶标记和放射性同位素标记这三大抗体标记技术是目前免疫化学、免疫学以及分子生物学中应用最广的常规抗原检测手段。但在微量抗原检测上,荧光标记及酶标记技术还缺乏足够的灵敏性。放射性同位素标记技术在实际操作中由于需要特殊的设备和安全防护,因此限制了它在实际过程中的广泛应用。
本课题研究一种免疫检测方法,用纳米金珠探针检测抗原,将免疫信号转化成核酸信号,然后通过吖啶酯杂交保护实验检测DNA的量从而获知抗原的水平。本课题完成了以下研究内容:
1.制备了纳米金磁探针。纳米金磁微粒具有超顺磁性和金表面生物分子固定化的性能,操作简单,而且,可以很好地解决生物大分子在微流控芯片微通道中的操纵。每个纳米金磁可包被抗体2-3个。根据ELISA的检测结果,包被到纳米金磁上的抗体保留了免疫活性,为后续的抗原检测做好了准备。
2.制备了纳米金珠探针。利用纳米金珠标记抗体和报告DNA,可以将免疫信号转换为核酸分子信号,对提高检测的灵敏度起到了十分重要的作用。纳米金珠包被抗体的蛋白用量为3μg/ml,即每个纳米金珠表面包被抗体1-2个。免疫斑点实验证明,经抗体和DNA修饰后的纳米金珠,其表面抗体没有失去活性。
3.应用吖啶酯杂交保护实验(HPA)检测报告DNA。应用化学发光标记物吖啶酯(AE)标记寡核苷酸探针与基因转录产物靶序列杂交,并通过碱性水解试剂消除未杂交探针的化学发光能力来达到分离的效果,通过碱性水解的方法,6分钟可以将背景信号降低3个数量级,无需转移分离,简化了操作步骤,可以检测达到amol级寡核苷酸。基于纳米颗粒和吖啶酯杂交保护实验的抗原检测方法,可以检测到320pg/ml羊抗鼠IgG-HRP抗原。
本课题所研究的基于纳米微粒系统及吖啶酯杂交保护实验的抗原检测方法,具有操作简单,便于自动化等优势,同时该方法也可用于其他疾病的免疫检测。本课题制备的纳米金磁探针和纳米金珠探针为芯片实验室的建立奠定了基础。