【摘 要】
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菠萝（Ananas comosus L.）为凤梨科多年生草本植物,是世界重要的热带果树之一。本课题组前期一系列的研究表明:Ac SERK1是菠萝体细胞胚发生受体类激酶基因,其TSS上游-921 nt/-881 nt区具有胚性细胞特异性启动活性。在此基础上,以-921 nt/-881 nt为诱饵,通过酵母单杂交从菠萝c DNA文库中初筛到了32种蛋白编码基因,其中的菠萝SET3（AcSET3）和菠萝
【基金项目】
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国家自然科学基金,AcSERK1基因在菠萝体细胞胚发生初期特异性表达的分子机制（30971984）,2016.09-2019.12； 国家重点研发计划项目子项目,菠萝组织器官分化相关转录因子的筛选及其调控机制（2018FYD1000504-5）,2018.7-2022.12； 广东省优稀水果产业技术体系,种质资源评价与特色品种选育
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菠萝（Ananas comosus L.）为凤梨科多年生草本植物,是世界重要的热带果树之一。本课题组前期一系列的研究表明:Ac SERK1是菠萝体细胞胚发生受体类激酶基因,其TSS上游-921 nt/-881 nt区具有胚性细胞特异性启动活性。在此基础上,以-921 nt/-881 nt为诱饵,通过酵母单杂交从菠萝c DNA文库中初筛到了32种蛋白编码基因,其中的菠萝SET3（AcSET3）和菠萝Ricin B-like（Ac RBL）可能是与胚性细胞特异性区段结合的蛋白编码基因。AcSET3是组蛋白超家族蛋白,含有H3结构域;Ac RBL属于RBL Lectin超家族中的RBL家族,是一类与蓖麻毒素ricin蛋白B亚基具有类似结构域的蛋白。为明确AcSET3、Ac RBL是否与Ac SERK1的TSS上游-921 nt/-881 nt区结合,本文通过克隆、生物信息学分析、表达特征分析、功能验证等进一步鉴定它们与该胚性细胞特异性区段的互作关系。利用Phytozome和NCBI分析显示:AcSET3位于6号染色体上,c DNA全长711 bp,ORF长411 bp,编码136个氨基酸,5’UTR长257 bp,3’UTR长43 bp;Ac RBL位于4号染色体上,c DNA全长942 bp,ORF长570 bp,编码189个氨基酸,5’UTR长69 bp,3’UTR长303 bp。应用Wolf PSORT在线软件预测结果表明,AcSET3、Ac RBL均定位于细胞核中;进一步的亚细胞定位实验显示:融合蛋白AcSET3-GFP、Ac RBL-GFP均在细胞核中表达,与预测结果相符。RT-qPCR分析结果表明,在2,4-D诱导培养基中AcSET3、Ac RBL在诱导的第10 d出现最高峰,比Ac SERK1表达高峰期早10 d左右;在高盐、高温、低温、ABA、SA和Me JA等胁迫处理下,两个基因的表达量均下降;两个基因在苞片、萼片、花盘、花托、子房壁、胎座、花柱、胚珠、雄蕊、果芯、花瓣、茎、叶和根中表达结果显示,AcSET3在雄蕊中的表达量最高,Ac RBL在胎座和根中的表达量最高。将含-921 nt/-881 nt区的重组载体LUC-Ac SERK1（-921 nt/-881 nt）-35S mini及含AcSET3、Ac RBL编码区的p Green62sk-AcSET3/Ac RBL重组载体,通过农杆菌介导转化烟草后的双荧光素酶活性分析结果显示,AcSET3和Ac RBL可分别使Ac SERK1启动子活性增强5.4倍和3.0倍,表明这两种蛋白可以激活Ac SERK1的TSS上游-921 nt/-881 nt区的活性。将pGADT7-AcSET3和pGADT7-Ac RBL重组载体转入诱饵酵母菌株Y1H gold（含诱饵序列-921 nt/-881 nt）中,在缺失培养基SD/-Leu/-Ab A500 ng/m L进行筛选培养后发现,实验组酵母菌生长旺盛,表明AcSET3、Ac RBL可能与Ac SERK1的TSS上游-921 nt/-881 nt区存在结合。为了确定AcSET3和Ac RBL与-921nt/-881 nt结合的更小区段。继续将以上两个重组载体转入诱饵酵母（-921 nt/-893nt、-917 nt/-881 nt）,通过在营养缺陷培养基SD/-Leu/-Ab A300 ng/m L上生长情况观察表明,AcSET3与Ac SERK1的TSS上游-893 nt/-881 nt区存在结合,Ac RBL与Ac SERK1的TSS上游-917 nt/-893 nt存在结合。构建2个酵母效应质粒pGBKT7-AcSET3和pGBKT7-Ac RBL,分别转入酵母菌株Y2H中,并分别在缺陷培养基SD/-Trp、SD/-Trp/-Ade/-His上筛选培养,结果显示:AcSET3和Ac RBL均具有转录激活功能。而添加550 ng/m L的Ab A可以抑制AcSET3转录激活活性,500 ng/m L可以抑制Ac RBL转录激活活性。以上结果表明,AcSET3和Ac RBL可能是Ac SERK1的TSS上游-921 nt/-881nt区的结合蛋白,并在激活Ac SERK1启动子的TSS上游-921 nt/-881 nt区段的表达中发挥作用。
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