第一部分巨噬细胞标志物在血管瘤中的表达及分布目的：巨噬细胞在肿瘤发生发展、动脉粥样硬化及胰岛素抵抗性肥胖症等病理过程均发挥着重要作用,本部分研究目的在于探究巨噬细胞及其亚型M1及M2型巨噬细胞标志物在血管瘤各期中的表达及分布,并分析其与细胞增殖、脂肪分化相关指标及Akt、Erk:1/2信号通路活化之间的关系。方法：利用免疫组织化学分别检测巨噬细胞及其亚型标志物CD68、HLA-DR及CD163,及细胞增殖抗原Ki67、脂肪分化调控分子PPARγ、磷酸化Akt及Erkl/2在血管瘤增生期及消退期中的表达水平；采用免疫组织荧光检测CD68+HLA-DR+M1及CD68+CD163+M2型巨噬细胞在血管瘤中的分布；通过聚类分析对上述指标进行相关性分析。采用实时定量PCR技术检测巨噬细胞相关因子在血管瘤组织中的表达。结果：多数血管瘤组织中(12/13)均可检测到CD68、HLA-DR和CD163的表达,同时CD68+HLA-DR+的M1型巨噬细胞及CD68+CD163+的M2型巨噬细胞在血管瘤增生期及消退期均可被发现；巨噬细胞,包括M1及M2型巨噬细胞,主要分布于血管瘤组织的间质部分；同时定量分析显示巨噬细胞标志物在增生期血管瘤表达明显高于消退期,具有统计学差异。聚类分析显示巨噬细胞标志物与VEGF、Ki67、磷酸化Akt呈正相关,与PPARy呈负相关。实时定量PCR结果显示巨噬细胞相关因子TNF-α, IL-1β及TGF-β在血管瘤增生期内高表达。结论：多数血管瘤组织可检测到巨噬细胞及其亚型的分布,主要位于血管瘤组织的间质部分。巨噬细胞,包括Ml及M2型巨噬细胞在增生期的数量明显高于消退期。巨噬细胞标志物CD68、HLA-DR及CD163与VEGF、Ki67、磷酸化Akt的表达呈正相关,与PPARγ呈负相关,提示巨噬细胞可能参与了血管瘤的发展及消退。第二部分血管瘤干细胞分离、鉴定及血管瘤裸鼠模型的建立目的：血管瘤干细胞(hemangiomastem cell, HemSC)是利用CD133抗体标记从增生期血管瘤组织中分离的具有增殖、克隆形成及多项分化潜能的一类干细胞,将其注射于裸鼠皮下可模拟人类血管瘤的发展及消退,成为研究血管瘤发病机制的有力工具。本部分研究目的在于利用CD133抗体磁珠筛选出血管瘤干细胞,鉴定其表征后尝试建立血管瘤裸鼠模型。方法：利用CD133抗体磁珠结合磁性细胞筛选系统分离增生期血管瘤组织中的血管瘤干细胞,采用流式细胞术对其表面标志物进行分析,进一步利用MTT增殖试验、克隆形成试验、分化试验检测分离出的血管瘤干细胞的细胞学特点。将分离的血管瘤干细胞与基质胶混合后注射于裸鼠皮下建立血管瘤裸鼠模型。结果：利用CD133抗体筛选的血管瘤干细胞呈现出成纤维细胞样形态,具有较强的增殖能力及克隆形成能力,同时表达干细胞转录因子AML1及Oct-4；分离的血管瘤干细胞膜表面内皮细胞标志分子CD31、CD34、CD146表达呈弱阳性,间质细胞标志物CD105、CD90呈阳性,间质干细胞标志物STRO-1表达水平较低；分化试验显示其具有多向分化潜能,可向脂肪细胞、成骨细胞及内皮细胞分化。利用血管瘤干细胞建立的血管瘤裸鼠模型具有血管形成、脂肪分化等特点,可部分模拟人类血管瘤发展特点。结论：分离培养的血管瘤干细胞具有快速增殖、克隆形成及多向分化等能力,表达间质细胞及内皮细胞标志物。利用其可建立具有人类血管瘤发展特点的血管瘤裸鼠模型。第三部分巨噬细胞对血管瘤干细胞增殖、分化的影响及机制研究目的：本部分研究目的在于通过建立血管瘤干细胞与巨噬细胞的共培养体系,在体外环境中检测不同极性巨噬细胞(M1及M2型巨噬细胞)对血管瘤干细胞增殖及脂肪分化的调控作用及机制,同时检测血管瘤干细胞对单核细胞的影响。方法：利用条件培养基及Transwell系统建立血管瘤干细胞与单核/巨噬细胞之间的间接共培养体系,采用EdU掺入试验、MMT试验检测巨噬细胞对血管瘤干细胞增殖能力的影响,采用油红O染色检测巨噬细胞对血管瘤干细胞脂肪分化的作用,并利用蛋白芯片、免疫印迹等技术探究巨噬细胞对血管瘤干细胞产生作用的分子机制,利用信号通路特异性抑制剂验证相关信号通路的作用。结果：M1及M2型巨噬细胞条件培养基均可促进血管瘤干细胞的增殖、抑制其脂肪分化,采用胞内信号蛋白芯片及免疫印迹检测显示巨噬细胞条件培养基可活化血管瘤干细胞内Akt及Erk1/2信号通路,利用小分子特异性抑制剂LY294002及PD98059可明确Akt的活化介导了巨噬细胞促进血管瘤干细胞的增殖,Erk1/2的活化介导了巨噬细胞抑制血管瘤干细胞的脂肪分化。利用Transwell间接共培养系统发现HemSC可促进THP-1的增殖及Akt的活化,对THP-1的分化无明显影响。结论：巨噬细胞可通过活化血管瘤干细胞内的Akt及Erkl/2信号通路促进其增殖并抑制其脂肪分化,血管瘤干细胞则可促进单核细胞系THP-1的增殖,对其分化无明显影响。第四部分巨噬细胞在血管瘤裸鼠模型中的作用研究目的：上述研究显示巨噬细胞可能在血管瘤的发展过程中起到重要作用,本部分研究目的在于建立巨噬细胞参与的血管瘤裸鼠模型,并基于此模型探究巨噬细胞在血管瘤增生期及消退期的作用及机制,验证上述实验部分的结果。方法：通过按一定比例混合血管瘤干细胞及单核细胞系THP-1(HemSC:THP-1=4:1),注射于裸鼠背部皮下,分别于7天、14天、28天及56天后收获血管瘤裸鼠模型标本,利用免疫组织化学、免疫组织荧光、实时定量PCR等技术检测巨噬细胞标志物及相关因子的表达,及细胞增殖、脂肪分化相关指标的表达及Akt、Erk1/2信号通路的活化。结果：混合THP-1的血管瘤模型(THP-1组)相对于单纯注射HemSC模型(对照组),标本组织具有更高的细胞密度,其中cyclinD1染色强度明显增高,提示巨噬细胞在血管瘤模型中促进了血管瘤细胞的增殖。同时,THP-1组标本具有更高的微血管密度(MVD)及CD31表达,提示巨噬细胞促进了血管瘤中的血管形成。THP-1组标本的脂质空泡减少及PPARγ表达明显减少,提示巨噬细胞抑制了血管瘤的消退,同时发现巨噬细胞可促进血管瘤细胞Akt及Erk1/2信号通路的活化。结论：利用巨噬细胞参与的血管瘤裸鼠模型,证实巨噬细胞可促进血管瘤的增殖及血管形成、抑制其脂肪分化,活化血管瘤细胞的Akt及Erkl/2信号通路,提示巨噬细胞可能在促进血管瘤增生期的进展,抑制其消退方面发挥重要作用,且这种作用可能依赖于Akt及Erkl/2信号通路。