研究背景子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一,近年来,发病率呈逐年上升趋势,且有趋向年轻化的特点。据报道,子宫内膜癌发病率在我国女性生殖系统恶性肿瘤中居于第二位,仅次于宫颈癌(cervical carcinoma,CC),且死亡率位居第三位。而在美国和欧洲等国家,其发病率远远超过了 CC及卵巢癌(ovarian carcinoma,OC),位居女性生殖系统恶性肿瘤首位。其主要病理类型为子宫内膜样腺癌,占70-80%。子宫内膜癌患者多有异常的阴道流血,易于早期发现、识别,就诊时往往处于早期。相对于其它女性生殖系统恶性肿瘤预后略好,早期子宫内膜癌5年生存率(5 year survival rate,5-YSR)约为90%,但晚期子宫内膜癌患者5-YSR较低,下降至50%,发生肿瘤远处转移患者5-YSR甚至下降至20%以下。因此,寻找敏感性和特异性较强的治疗新靶点,对子宫内膜癌的早期诊断和靶向治疗具有非常重要的临床意义。叉头框蛋白(forkhead box O,FOXO)属于叉头框(FOX)转录因子家族,该家族最早在研究果蝇时被发现,于2000年被统一命名为Forkhead转录因子家族。FOXO1在对泡状横纹肌肉瘤的研究中被发现,是本亚家族中发现的第一个成员。其广泛表达于人各种正常组织中,具有多种生物学活性,参与肝糖原产生、细胞周期调节、脂肪细胞分化、细胞凋亡、伤口愈合等多种生理及病理过程。同时FOXO1是PI3K/Akt信号转导通路的下游基因,该通路是肿瘤发生过程中非常重要的信号转导通路。多种癌基因及抑癌基因可通过调节PI3K/Akt信号通路活性在肿瘤发生、发展中发挥作用。研究发现,FOXO1在多种肿瘤的发生、发展中也起到非常关键的作用。先前有研究报道,FOXO在乳腺癌、宫颈癌、胃癌、前列腺癌等肿瘤中表达较正常对照组显著降低。且研究提示,重新再表达FOXO1,恢复其转录活性,可使肿瘤生长受到抑制,这有可能给肿瘤的靶向治疗提供新的思路。固醇调控元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding protein,SREBP)是调节脂质合成的非常重要的转录因子。以往对于SREBP1的研究主要集中在糖尿病、脂肪合成、脂肪肝等方面。近年来,其在肿瘤发生、发展中的作用日渐受到人们的关注。研究表明,SREBP1在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等肿瘤中表达升高,其作为一种癌基因,与肿瘤的进展、转移等密切相关。研究表明,FOXO1能抑制子宫内膜癌细胞生长,其可能会作为抑癌基因发挥作用,但其具体分子机制尚不清楚。本课题组前期对SREBP1的研究发现,其在子宫内膜样腺癌中的表达明显高于正常内膜组织,SREBP1能促进子宫内膜样腺癌细胞的生长、侵袭及转移,同时体内实验也证实了它促进内膜癌细胞生长的作用。FOXO1和SREBP1在脂质合成和子宫内膜癌的发生过程中均发挥重要作用,但具体机制尚不清楚。研究显示FOXO1活化后能通过降低Sp1及SREBP-1c活性,而抑制SREBP转录,二者在子宫内膜癌中是否存在某种联系尚无人报导。另外,FOXO1与肿瘤之间的关系也渐渐成为许多研究人员的关注点,因此本课题主要致力于探究FOXO1在子宫内膜癌发生和发展中的作用以及具体机制,研究内容分为以下三部分。第一部分FOXO1在子宫内膜样腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性目的:已有研究表明FOXO1在乳腺癌、宫颈癌、胃癌、前列腺癌等肿瘤中表达明显降低,而FOXO1在子宫内膜癌中表达及其与肿瘤临床病理特征的相关性尚不完全明确。本研究检测FOXO1mRNA和蛋白在正常子宫内膜组织、不典型增生子宫内膜组织及子宫内膜样腺癌组织中的表达情况,同时探讨FOXO1蛋白表达与子宫内膜样腺癌临床病理特征(患者年龄、肿瘤组织分化程度、临床病理分期、淋巴结转移情况)的相关性,初步证实FOXO1在子宫内膜样腺癌发生及发展过程中的作用。方法:本研究基于TCGA数据库分析了FOXO1mRNA在子宫内膜癌和癌旁正常子宫内膜中的差异表达;采用实时荧光定量PCR分析FOXO1 mRNA在子宫内膜癌和癌旁正常子宫内膜中的表达情况;采用免疫组织化学技术检测FOXO1蛋白在正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜和子宫内膜样腺癌组织中的表达情况;运用SPSS统计软件分析FOXO1的表达与子宫内膜样腺癌临床病理特征(患者年龄、肿瘤组织分化程度、临床病理分期、淋巴结转移情况)的相关性。结果:1.TCGA公共数据库的基因表达谱芯片分析显示,与癌旁正常子宫内膜相比,子宫内膜癌组织中FOXO1 mRNA表达显著降低,P<0.01。2.RT-PCR结果显示,与癌旁正常组织相比,子宫内膜样腺癌组织中FOXO1 mRNA表达显著降低,P<0.01。3.免疫组化结果显示,FOXO1在正常子宫内膜、不典型增生子宫内膜和子宫内膜样腺癌组织中的阳性表达率分别90%、85.00%、45.07%。与正常子宫内膜和不典型增生子宫内膜组相比,子宫内膜样腺癌组织中FOXO1阳性表达率显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),正常子宫内膜组与不典型增生子宫内膜组差异不显著(P>0.05)。4.71例子宫内膜样腺癌患者FOXO1的阳性表达率与年龄、组织分化程度、临床病理分期、淋巴结转移情况的相关性分析显示,子宫内膜样腺癌中低分化组织中FOXO1的阳性表达率(38.18%)明显低于高分化组(68.75%),差异有统计学意义(P<0.05);Ⅲ、Ⅳ期FOXO1阳性表达率(16.67%)明显低于Ⅰ、Ⅱ期(50.85%),差异有统计学意义(P<0.05);有淋巴结转移组FOXO1阳性表达率(11.11%)明显低于无淋巴结转移组(50.00%),差异有统计学意义(P<0.05)。<60岁年龄组FOXO1阳性表达率与≥60岁年龄组FOXO1阳性表达率无显著差异(P>0.05)。结论:1.FOXO1在子宫内膜样腺癌组织中低表达,FOXO1在子宫内膜样腺癌中可能作为抑癌基因发挥作用。2.FOXO1的表达与子宫内膜样腺癌组织分化程度、临床病理分期、淋巴结转移情况密切相关。第二部分FOXO1对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响目的:已有研究表明FOXO1在多种肿瘤的发生、发展中起到非常关键的作用,而其在子宫内膜癌中的具体作用及机制尚未见报道。本研究通过检测FOXO1在子宫内膜癌细胞系 HEC-1-A、RL95-2、AN3-CA、SPEC-2、Ishikawa、KLE 中的表达情况,应用慢病毒载体过表达FOXO1,研究FOXO1过表达对子宫内膜癌细胞增殖、生长、迁移、侵袭和体内成瘤的影响以及FOXO1与SREBP1的相关性,进一步探讨FOXO1在子宫内膜样腺癌发生、发展过程中的作用。方法:应用蛋白质免疫印迹技术检测6种子宫内膜癌细胞系中FOXO1的表达情况,构建带GFP荧光FOXO1过表达及空质粒慢病毒载体,筛选出稳定转染的子宫内膜样腺癌细胞系。分别用MTT实验、平板克隆形成实验、transwell实验、体内成瘤实验检测FOXO1过表达对子宫内膜样腺癌细胞生物学行为的影响,并运用蛋白质免疫技术检测FOXO1过表达对SREBP1表达情况的影响。结果:1.蛋白质免疫印迹结果显示6株子宫内膜癌细胞:HEC-1-A、RL95-2、AN3-CA、SPEC-2、Ishikawa、KLE 中,FOXO1 蛋白在 AN3-CA、SPEC-2、Ishikawa、KLE四株子宫内膜癌细胞系中的表达水平较低。选择低分化子宫内膜样腺癌细胞:AN3-CA,高分化子宫内膜样腺癌细胞:Ishikawa,进行后续慢病毒载体转染及实验。2.病毒转染后倒置荧光显微镜观察FOXO1过表达慢病毒在子宫内膜样腺癌细胞AN3-CA、Ishikawa中的转导效率分别为91.42%、87.94%,转染有效。3.MTT结果显示,过表达慢病毒载体组细胞增殖速度明显低于空白载体组(P<0.05)。4.平板克隆形成实验结果显示,过表达慢病毒载体组肉眼可见克隆形成数目显著少于空白载体组(P<0.05)。5.迁移和侵袭实验结果显示,过表达慢病毒载体组细胞迁移和细胞侵袭数目明显少于空白载体组(P<0.05)。6.蛋白质免疫印迹结果显示,过表达慢病毒组SREBP1蛋白的表达明显低于空白载体组(P<0.05)。7.裸鼠移植瘤实验结果显示,过表达慢病毒载体组移植瘤形成和生长速度明显低于空白载体组(P<0.01)。注射28天后,过表达慢病毒载体组移植瘤重量显著小于空白载体组(P<0.01)。结论:1.FOXO1在子宫内膜样腺癌中发挥抑癌基因作用,FOXO1过表达可抑制肿瘤细胞的增殖、生长、迁移和侵袭能力。2.FOXO1过表达可抑制子宫内膜样腺癌细胞的体内成瘤能力。第三部分FOXO1对子宫内膜癌的作用机制研究目的:我们前期的研究表明FOXO1和SREBP1在子宫内膜癌的发生发展过程中均发挥重要作用,且已有研究显示FOXO1活化后能通过降低Sp1及SREBP-1c活性,而抑制SREBP转录,但二者在子宫内膜癌中的相关性及具体作用机制尚不明确。FOXO1是PI3K/Akt信号转导通路的下游基因,该通路是肿瘤发生过程中非常重要的信号转导通路,同时该通路活性可被多种癌基因及抑癌基调节,从而在肿瘤发生、发展中发挥作用。本研究拟分析FOXO1与SREBP1的互作情况,同时检测FOXO1过表达对PI3K/AKT信号转导通路的影响,初步探讨FOXO1在子宫内膜癌中发挥抗肿瘤作用的分子机制。方法:运用免疫共沉淀技术分析FOXO1与SREBP1的互作情况,并应用蛋白质免疫印迹技术检测FOXO1过表达对PI3K/AKT信号转导通路的影响。结果:1.免疫共沉淀结果表明,SREBP1是FOXO1的一种互作蛋白,FOXO1可能会通过与SREBP1互作在子宫内膜样腺癌中发挥抗肿瘤作用。2.Western blot结果显示,与对照组相比,FOXO1过表达显著降低了 AN3-CA和Ishikawa细胞系中PI3K和AKT的磷酸化水平(P<0.05),FOXO1过表达抑制了 PI3K/AKT信号转导通路。结论:1.FOXO1可与SREBP1发生相互作用来发挥抗肿瘤作用。2.FOXO1可能通过PI3K/AKT信号转导通路发挥抑制子宫内膜样腺癌作用。3.FOXO1可能是子宫内膜样腺癌治疗的一个新靶点,本研究为子宫内膜样腺癌的基因治疗提供了新的思路和线索。