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microRNA（miRNA）是18-23 nt的内源性、非编码、单链小核糖核酸RNA。它是参与基因表达调控的重要因子,在生命过程中发挥着重要的作用,如细胞分裂、应激、凋亡和自噬过程等,而且在多种疾病（如癌症、心血管疾病、退行性病变、糖尿病等）的发生和进展过程中miRNA常常异常表达,因而被众多研究者视为一种极具潜力的生物标志物和基因治疗的新靶点。由于miRNA具有序列短、丰度低、家族同源性高及表达异质性高的特点,miRNA的检测具有很大的难度。研究表明,多重的、系统的疾病标志物检测比单一的标志物更能准确判断疾病的发展和指导用药。但目前针对miRNA的活细胞原位多重检测存在有很多技术壁垒:（1）目前对miRNA多重检测最常用的方法是荧光定量PCR（qPCR）和基因芯片技术,他们需要复杂的体外处理过程,测试结果受操作者熟练程度干扰性大、污染风险高,无法反映miRNA的原位空间信息。（2）原位的多重miRNA检测方法被荧光光谱重合的问题所限制,很难同时监测4种及以上的目标miRNA。（3）多重原位杂交（multi-FISH）的方法虽然被很多研究者用于RNA的细胞原位多重检测,但由于此方法需要使用细胞毒性大的通透和洗脱试剂,无法被应用于活细胞体系中。因此,迫切需要构建高灵敏度、高选择性的miRNA活细胞原位多重检测体系。基于以上思考,本论文围绕活细胞及细胞器miRNAs多重检测及动态监测,结合纳米及分子生物学技术,构建了 3种高效成像检测策略,具体工作如下:1.具有空间分辨、错误矫正功能的活细胞内miRNAs的多重检测策略精确测定单个活细胞中多个miRNAs的拷贝数和空间位置对于理解细胞行为和功能是非常必要的。然而由于荧光光谱重叠问题,在单个活细胞中同时成像多个miRNAs仍然具有挑战性。本课题提出了一种具有空间分辨能力且具有错误矫正功能的荧光标记编码方法,称为纠错荧光编码探针（fluorophores encoded error-corrected label,FluoELs）。FluoELs 体系包括用于编码的比例型双荧光染料Cy3\Cy5和用于错误校正的恒定量的单荧光染料AMCA,同时在核壳二氧化硅载体表面连接分子信标（MB）探针用于检测活细胞内miRNAs的浓度。FluoELs细胞毒性低,且通过比例型识别能克服光谱重叠提高待测目标物的通量,从而实现了空间解析和量化乳腺癌细胞中的9种miRNAs,并能评估它们的单细胞异质性。FluoELs为测定活细胞中多种miRNAs的表达谱和探索其分子机制提供了一个单细胞水平的分析平台。2.多重细胞器画像编码子技术对活细胞中miRNA原位阵列检测直接对单个活细胞内亚细胞器中多个miRNAs的可视化成像将增强科学家对miRNAs时空信息的认知,对研究细胞器miRNAs生物医学功能意义重大,但是这是目前的常规分析方法所无法实现的。本课题介绍了多重细胞器画像条形码（multiplexed organelles portrait barcodes,MOPB）技术,它利用负载不同比例的荧光染料的壳核介孔二氧化硅纳米粒子作为载体,克服了光谱重叠的限制,实现多重miRNAs的识别。同时,细胞器定位的靶向肽（Targeting peptide,TP）分子和目标miRNA特异性定量检测的MB探针被同时负载到载体表面,实现了活细胞中不同细胞器内miRNAs的多重可视化分析。在药物诱导的Ca2+稳态破坏引发线粒体和内质网压力的刺激下,利用MOBP技术,成功实现原位成像分析线粒体和内质网中多达8种miRNAs的表达改变。MOBP技术为活细胞亚细胞器中多种分子标志物的同时分析研究提供了一个新的思路和方法。3.正交多色编码杂交链式反应放大器用于活细胞中多重miRNAs分析由于光谱重叠的问题,活细胞中4种以上的miRNAs荧光成像和定量具有挑战性,限制了活细胞内miRNAs的信号通路、代谢通路以及调控机制的研究。本课题开发了一种基于荧光正交编码杂交链式反应的多重编码成像策略,称为多色编码杂交链式反应放大器（multicolor encoded hybridization chain reaction amplifiers,multi-HCR）。这种多色 HCR 放大器可以在活细胞内目标miRNAs的存在下进行正交自组装。由于其序列特异性和可编程性的突出优点,使用4色multi-HCR时可以同时形成15种不同的荧光组合。所构建的multi-HCR可以同时监测缺氧诱导的活细胞凋亡和自噬的过程中的8种miRNAs的变化,从而使对疾病发生过程中多种miRNA目标物的直接可视化分析成为可能,为剖析活细胞在复杂生理病理过程中多种生物标志物的变化提供了一个高效的检测方法。