冠心病（Coronary heart disease, CHD）严重危害着人类的健康,被称作是“人类的第一杀手”。据2012中国心血管疾病报告：全国心血管病患者约有2.9亿,每10秒钟就有一人死于心血管病,其中冠心病死亡率占心血管疾病的10-20%。糖尿病（Diabetes mellitus, DM）是目前人数增长速度最快的慢性疾病,目前全球约有2.5亿糖尿病患者,预期到2025将达到3.8亿,其中90-95%为2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus, T2DM）.糖尿病的并发症比较多,其中并发的心血管疾病的高发病率、高致死率备受关注,冠心病在成人糖尿病患者中发病率约为55%。冠脉再通治疗是目前治疗冠心病最为有效的手段,但随之而来的“心肌缺血再灌注损伤”（Myocardial ischemic reperfusion injury, MIRI）在改善心肌供血的同时又加重了单纯心肌缺血所造成的损伤。而糖尿病在冠心病MIRI中扮演角色颇有争议,部分学者认为糖尿病加重MIRI。我们在临床中发现合并2型糖尿病的冠心病患者行经皮冠状动脉介入术（Percutaneous coronary intervention, PCI）后发生MIRI的程度亦不同,因此拟进一步探讨其之间的关联及潜在机制。高糖状态可引起机体的氧化应激反应增强,活性氧（Reactive oxygen species,ROS）过量生成。NADPH氧化酶（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH oxidase）是心肌细胞中ROS的主要来源,Nox2 （NADPH oxidase 2）是其在心肌细胞中表达的主要亚型。有研究表明高糖导致ROS增加,可提高人单核细胞瞬时受体电位（Transient receptor potential, TRP）表达。TRP通道是位于细胞膜上的一类重要的阳离子通道,主要通过钙离子。其中经典瞬时受体电位6 （Canonical transient receptor potential 6, TRPC6）在心血管系统广泛表达,参与多种心血管疾病发病过程,研究提示TRPC6表达提高可促使钙离子内流增加,加速了各种心脏疾病的恶化。目前认为MIRI发生的中心机制是钙超载,启动细胞凋亡。TRPC6作为钙离子通道是否参与其中仍不得而知。核转录因子κB（Nuclear factor-κB, NF-κB）是细胞内普遍存在的一种具有多向调节作用的转录因子,研究表明NF-κB与MIRI相关,且TRPC6启动子区拥有NF-κB的结合位点。C-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）细胞信号转导通路是心肌细胞凋亡的重要信号通路,JNK介导的细胞凋亡参与MIRI的发生,有三个亚型（JNK1,JNK2和JNK3）,其中JNK1、JNK2广泛表达。目前研究证实JNK/NF-κB信号通路参与心肌细胞凋亡。而在ROS和JNK之间可能存在一个正反馈效应,ROS可以促进JNK的活化,活化的JNK反过来刺激产生更多的ROS,最终JNK被持续活化。高糖导致的NADPH氧化酶活化、ROS增加与JNK2/NF-KB在高糖MIRI之间扮演何种角色,是否与TRPC6相关,及Nox2在其中的表达情况,尚需要进一步探讨。MIRI的发病机制及防治的研究已有半个世纪的历史,一直是生物医药领域研究的热点,但目前尚无有效的防治手段。中药防治MIRI在基础及临床实验中得到证实。丹参是我国传统中药,目前丹参注射液（Danshen injection, DSI）已广泛应用于临床治疗心血管疾病及糖尿病,其中丹参素（Danshensu,DSS）作为公认的有效成分含量最高,对其生物活性的高低起主要作用。研究表明丹参能降低细胞内钙超载、减轻MIRI损伤,但具体作用于何种钙通道,具体的信号转导机制仍未可知。因此,本研究旨在探讨丹参素及丹参注射液在高糖环境下MIRI中的作用,是否与TRPC6、Ca²⁺内流相关,了解NADPH氧化酶及Nox2/ROS/JNK2/NF-κB信号通道在高糖MIRI中的调控作用,为糖尿病MIRI机制和临床治疗提供更充分的理论依据。目的：临床观察2型糖尿病与心肌缺血再灌注损伤的关系,TRPC6在其中扮演的角色及丹参注射液的保护作用；进一步通过基础研究考察葡萄糖浓度与H9c2细胞缺氧再复氧损伤的关系,了解TRPC6表达水平、钙离子内流及凋亡在其中的影响,并探讨Nox2/ROS/JNK2/NF-κB信号通路的调节作用,考察丹参素对高糖心肌缺血再灌注的保护作用及其干预机制,为丹参防治糖尿病心肌缺血再灌注损伤机制和临床治疗提供更充分的理论依据。方法：1.临床分组为冠心病（CHD）组136例和正常对照组（Control）95例,所有对象均行冠脉造影术（Coronary angiography, CAG）,冠心病组为狭窄程度为≥75%的稳定性心绞痛拟行冠状动脉介入（PCI）治疗的患者。测定PCI术或CAG术前及术后第一天肌酸激酶同工酶MB（Creatine kinase MB, CKMB）含量。所有入选对象术前CKMB低于32u/L。记录入选对象的年龄、性别,计算体重指数（Body mass index, BMI）,检测：总胆固醇（total cholesterol, TC）、低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein, LDL）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、糖化血红蛋白（HbAlc）、血肌酐（Serum Creatinine, SCr）、尿酸（Uric acid,UA）含量,随机血糖（Random blood glucose, RBG）,记录冠状动脉血管狭窄、植入支架数目,术后24小时心律失常评分等。分析PCI术及CAG术前及术后第一天CKMB的关系。分析PCI术后第一天CKMB增高与上述指标的关系。2.入选研究对象共25例,根据有无T2DM、糖化血红蛋白含量情况分为以下五组：1)Control:冠脉造影排除冠心病；2)CHD：冠脉造影明确为冠心病不合并T2DM患者；3)CHD+H1：冠脉造影明确为冠心病合并T2DM,轻度糖化血红蛋白增高,糖化血红蛋白<8%；4)CHD+I-12：中度糖化血红蛋白增高,糖化血红蛋白介于8-10%；5)CHD+H3：重度糖化血红蛋白增高,糖化血红蛋白>10%。Western Blot检测研究对象的单核细胞的TRPC6蛋白表达。3.入选冠心病患者30例,冠心病合并T2DM且糖化血红蛋白超过10%的患者20例,均给予胰岛素（Insulin）降糖,其中10例除胰岛素外,合并给予丹参注射液静脉使用7天,其后接受PCI术；冠心病不合并T2DM患者10例。按照丹参注射液使用情况及PCI术前后,比较以下六组：1)CHD:冠脉造影明确为冠心病,不合并T2DM患者；2)CHD+DSI:冠脉造影明确为冠心病,不合并T2DM患者,给予丹参注射液静脉使用7天；3)CHD（H3）：冠脉造影明确为冠心病,合并T2DM患者,糖化血红蛋白>10%；4)CHD（H3）+Insulin（胰岛素）：冠脉造影明确为冠心病,合并T2DM患者,糖化血红蛋白>10%,给予胰岛素降糖；5)CHD（H3）+Insulin+DSI:除给予胰岛素降糖外,给予丹参注射液静脉使用7天；6)CHD（H3）+Insulin+DSI+PCI1d:PCI术后1天。Western Blot法分别检测六组TRPC6蛋白表达。4.冠心病合并T2DM患者,糖化血红蛋白超过7%的患者60例,除均给予常规药物治疗,随机分为两组：1)CHD+PCI 1 d:PCI术前未预先给予DSI静脉使用；2)CHD+DSI+PCI 1 d:PCI术前预先给予DSI静脉使用7天。其后接受PCI治疗,分别检测两组PCI术后1天心肌损伤因子CKMB.内皮素（Endothelin,ET）及丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的情况。5. 以H9c2细胞作为研究对象,设置以下四组：1)NG组（5 mmol/L D-葡萄糖培养）；2)LG组（15 mmol/L D-葡萄糖培养）；3)HG组（25 mmol/L D-葡萄糖培养）：4)MA高渗对照组（20 mmol/L甘露醇培养+5 mmol/L D-葡萄糖培养）,采用MTT检测各组细胞在孵育24 h、36 h、48 h、72 h后的增殖情况。6. 以H9c2细胞作为研究对象,设置以下六组：1)HG 3 h组：H9c2细胞培养基中D-葡萄糖含量25 mmol/L,为HG,培养3小时；2)HG 6 h组：HG培养6小时；3)HG 12 h组：HG培养12小时；4)HG 24h组：HG培养24小时；5)HG 48 h组：HG培养48小时；6)NG 48h组：H9c2细胞培养基中浓度为D-葡萄糖含量5 mmol/L,培养48小时。采用细胞qADPH氧化酶活性光度法检测不同组别的NADPH氧化酶,采用Western Blot法检测TRPC6蛋白表达情况。7. 以H9c2细胞作为研究对象,设置以下四组：1)NG组；2)LG组；3)HG组；4)MA高渗对照组。以上各组分别于相应葡萄糖浓度中各孵育48小时。采用细胞NADPH氧化酶活性光度法检测NADPH氧化酶、采用DCFH-DA荧光探针酶标仪检测ROS活性,采用Real time PCR检测TRPC6的mRNA表达,采用Western Blot法检测TRPC6蛋白表达。8. 以H9c2细胞作为研究对象,设置以下四组：1)NG组；2)LG组；3)HG组；4)MA高渗对照组。培养48小时后模拟缺血再灌注即缺氧2小时复氧3小时,检测CKMB、cTnI以及LDH含量,采用ELISA法检测凋亡调控因子BAX、BCL-2含量,流式细胞仪Fluo-3AM检测H9c2细胞内钙离子荧光强度, Annexin V-FITC/PI双染色法检测H9c2细胞凋亡情况。9. 以H9c2细胞作为研究对象,设置以下7组：1)NG组：5 mmol/L D-葡萄糖孵育H9c2细胞；2)MA组：20 mmol/L甘露醇+5 mmol/L D-葡萄糖孵育H9c2细胞；3) DSS 2+NG组：丹参素2 mg/L组预处理后NG孵育；4)DSS 10+NG:丹参素10 mg/L组预处理后NG孵育；5)DSS 50+NG组：丹参素50 mg/L组预处理后NG孵育；6)DSS 100+NG：丹参素100 mg/L组预处理后NG孵育；7)DMSO +NG:0.5% DMSO预处理后NG孵育。以上各组不同浓度丹参素预先与H9c2细胞共同孵育2小时,而后在NG或MA培养基中孵育48小时。采用MTT法检测各组细胞的增殖活力,考察丹参素本身的细胞毒性。10.以H9c2细胞作为研究对象,设置以下六组： 1)HG；2)DSS5+HG:DSS 5mg/L预处理后HG孵育H9c2细胞；3)DSS25+HG:DSS 25mg/L预处理后HG孵育；4)DSS 50+HG:DSS 50 mg/L预处理后HG孵育；5)DSS 100+HG: DSS 100 mg/L预处理后HG孵育；6)Tempol+HG:Tempol （100μM）（’ROS抑制剂）预处理后HG孵育。采用DCFH-DA荧光探针酶标仪检测ROS活性,Real time PCR检测TRPC6的mRNA表达,Western Blot法检测TRPC6蛋白表达情况；上述H9c2细胞给予缺氧再复氧,采用流式细胞仪Fluo-3AM检测H9c2细胞内钙离子荧光强度,Annexin V-FITC/PI双染色法检测H9c2细胞凋亡情况。11.以H9c2细胞作为研究对象,设置以下六组：1)NG 48 h：NG孵育48 h；2)HG1 h：HG孵育1 h；3)HG 6 h：HG孵育6 h；4)HG 12 h：HG孵育12 h；5)HG24 h：HG孵育24 h；6)HG 48 h：HG孵育48 h。采用Western Blot法检测1p-JNK2及细胞质和细胞核内NF-κB的蛋白变化。12.以H9c2细胞作为研究对象,设置以下四组：1)NG组；2)LG组；3)HG组：；4)MA组。孵育48小时。采用Western Blot法检测p-JNK2及细胞质和细胞核内NF-κB的蛋白变化。13.以H9c2细胞作为研究对象,设置以下4组：1)NG组；2)HG组；3)HG+PDTC（10μM） （NF-κB特异性阻断剂）组；4)HG+SP600125（10μM） （JNK抑制剂）。采用细胞NADPH氧化酶活性光度法检测NADPH氧化酶,采用Western Blot法检测Nox2、p-JNK2, NF-κB（细胞核内）及TRPC6蛋白表达。14.以H9c2细胞作为研究对象,采用JNK2siRNA特异性沉默JNK2基因,设置以下4组：1)NG组；2)HG组；3)HG+FAM siRNA组;4)HG+JNK2 siRNA组。进行siRNA瞬时转染后继续培养48 h,采用Western Blot法检测Nox2、JNK2. p-JNK2. TRPC6及细胞核内NF-κB蛋白的表达水平,采用DCFH-DA荧光探针酶标仪检测ROS活性；检测缺氧再复氧后CKMB、LDH水平变化。15.以H9c2细胞作为研究对象,采用Nox2 siRNA特异性沉默Nox2基因,设置以下6组：1)NG组；2)NG+FAM siRNA组;3)NG+Nox2 siRNA组;4)HG组;5)HG+FAM siRNA组;6)HG+Nox2 siRNA组。采用Western Blot法检测Nox2蛋白、p-JNK2、TRPC6、细胞核内NF-κB蛋白表达；采用细胞NADPH氧化酶活性光度法检测NADPH氧化酶；采用DCFH-DA荧光探针酶标仪检测ROS活性；缺氧再复氧后采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染色法检测H9c2细胞凋亡情况,采用ELISA法检测凋亡调控因子BCL-2、BAX含量。16.以H9c2细胞作为研究对象,设置以下7组：1)NG；2)HG组；3)D 10+HG组：丹参素10 mg/L预处理,HG孵育H9c2；4)D 50+HG：丹参素50 mg/L预处理；5)D 100+HG：丹参素100 mg/L预处理；6)PDTC+HG:PDTC预处理;7)SP600125+HG:SP600125预处理。采用Western Blot法检测p-JNK2蛋白表达,细胞核内NF-κB蛋白的表达。17.以H9c2细胞作为研究对象,设置以下6组：1)NG；2)HG组；3)D10+HG组：丹参素10 mg/L预处理,HG孵育H9c2；4)D 50+HG：丹参素50 mg/L预处理；5)D 100+HG：丹参素100 mg/L预处理；6)DPI+HG:DPI预处理（20μM）（NADPH氧化酶抑制剂）。采用光度法检测各组细胞NADPH氧化酶活性,采用Western Blot法检测各组Nox2蛋白表达。缺氧再复氧后,检测心肌损伤因子CKMB,cTnI、LDH含量,ELISA法检测凋亡调控因子BCL-2、BAX含量。结果1.冠心病PCI术后较对照组CAG术后CKMB含量明显增高。患者PCI术后CKMB增高与年龄、性别、体重指数、甘油三酯、血肌酐及尿酸等无明显相关,与总胆固醇、低密度脂蛋白、随机血糖、糖化血红蛋白、多支血管病变、植入支架数目等有关；logistic回归分析结果分析表明PCI术后CKMB增加与糖化血红蛋白增高关系最为密切,提示心肌缺血再灌注损伤与持续性血糖增高相关；2.冠心病合并T2DM患者随着糖化血红蛋白的增加,TRPC6蛋白含量明显升高,提示持续性血糖升高与TRPC6表达增加相关；冠心病合并糖化血红蛋白增高的患者,给予丹参注射液预处理后TRPC6蛋白表达明显下降；PCI术后血清中CKMB.ET、MDA等明显下降,提示丹参注射液能减轻冠心病合并糖化血红蛋白增高患者的心肌缺血再灌注损伤,与降低TRPC6表达相兼。3.高糖培养48 h时H9c2细胞的增殖达到最高;随着高糖培养时间的延长,H9c2细胞的NADPH氧化酶活性、TRPC6蛋白表达明显增加,呈现时间依赖性趋势,高糖培养48 h达到最高；不同浓度葡萄糖孵育H9c2细胞,NADPH氧化酶、ROS活性、TRPC6的mRNA和蛋白表达随着培养基中葡萄糖浓度的增加而增加,在高糖培养组中达到最高,提示高糖长时间培养可导致NADPH氧化酶、ROS活性、TRPC6表达增加。4.H9c2细胞在不同浓度葡萄糖孵育48 h后缺氧2小时复氧3小时,CKMB.cTnI、LDH、BAX含量,H9c2细胞内钙离子荧光强度、细胞凋亡情况随葡萄糖浓度增加而升高,在HG组时达到最高,BCL-2含量呈同步相反的下调改变。5.丹参素本身对H9c2细胞活力无明显影响,不同剂量丹参素预处理高糖孵育H9c2细胞,ROS水平、TRPC6的mRNA和蛋白表达呈剂量依赖性下降；丹参素预处理H9c2细胞后缺氧再复氧,随着丹参素浓度增加,H9c2细胞内钙离子荧光强度、细胞凋亡呈剂量依赖性下降,在DSS 100预处理组,各值达到最低；提示丹参素预处理降低高糖孵育H9c2细胞缺氧再复氧损伤,可能是通过降低ROS、TRPC6表达,而降低细胞内钙离子荧光强度,减少细胞凋亡有关。6.高糖培养H9c2细胞不同时间段,p-JNK2、NF-κB（细胞核内）蛋白表达随着培养时间延长而逐渐增加,48h时达到最高；不同浓度葡萄糖培养H9c2细胞,p-JNK2、NF-κB（细胞核内）蛋白表达呈浓度依赖性增加趋势,高糖组蛋白表达最高；NF-κB（细胞质内）蛋白表达呈逐渐下降的相反表达趋势,提示在高糖培养H9c2细胞过程中伴随着JNK2磷酸化,NF-κB的活化及内转移。PDTC预处理H9c2细胞后NADPH氧化酶活性、Nox2、p-JNK2蛋白表达无明显变化,SP600125预处理H9c2细胞能明显下调NADPH氧化酶活性,Nox2、p-JNK2蛋白表达下降；PDTC、SP600125预处理均能显著降低NF-κB（核内）及TRPC6蛋白表达,提示JNK2位于NF-κB及TRPC6的上游,并可影响Nox2表达。7. JNK2 siRNA转染H9c2细胞,能显著降低高糖环境下H9c2细胞Nox2p-JNK2、 NF-κB（核内）及TRPC6蛋白表达,ROS水平明显降低,缺氧再复氧后,CKMB、LDH水平亦明显降低；Nox2 siRNA转染H9c2细胞,能显著降低高糖环境下H9c2细胞Nox2、p-JNK2、NF-κB（核内）及TRPC6蛋白表达,NADPH氧化酶、ROS水平明显下降,Nox2 siRNA转染H9c2后接受缺氧再复氧,能明显降低细胞凋亡,促细胞凋亡因子BAX下调,抗细胞凋亡因子BCL-2上调。结合上述3、4及6结果提示高糖培养加重H9c2细胞的缺氧再复氧损伤,伴随NF-κB的活化内转移及TRPC6蛋白表达增加,Nox2、ROS与JNK2相互交叉,共存于NF-κB及TRPC6的上游,特异性沉默Nox2与JNK2,降低Nox2、p-JNK2,可降低高糖培养的H9c2细胞缺氧再复氧损伤。8.丹参素预处理高糖培养H9c2细胞,p-JNK2、NF-κB（细胞核内）蛋白表达随丹参素浓度增加呈下降趋势,D100预处理组的p-JNK2下降最为明显,同时SP600125预处理组的p-JNK2、NF-κB明显下降,PDTC预处理组NF-κB明显下降而p-JNK2蛋白表达无明显下降,提示丹参素预处理下调高糖培养H9c2细胞的JNK2磷酸化,减少NF-κB的活化及内转移。9.丹参素及DPI预处理高糖培养的H9c2细胞,NADPH氧化酶、Nox2蛋白表达呈剂量依赖性下降；缺氧再复氧后,心肌损伤因子CKMB、cTnI、LDH及促凋亡因子BAX明显下降,抗凋亡因子BCL-2明显增加,细胞凋亡明显减轻,提示丹参素预处理通过降低NADPH氧化酶、减少Nox2表达而降低高糖培养H9c2细胞缺氧再复氧损伤。结论：1.冠心病合并2型糖尿病患者易发生心肌缺血再灌注损伤,与糖化血红蛋白含量呈正相关,可能与持续性的高血糖促进TRPC6蛋白表达增加有关；丹参注射液能降低TRPC6蛋白表达,减轻冠心病合并2型糖尿病患者的心肌缺血再灌注损伤。2.H9c2细胞在高糖培养时易发生心肌损伤,可能与高糖通过调控Nox2/ROS/JNK2/NF-κB信号通路,促进TRPC6蛋白表达,加重心肌缺氧再复氧时钙离子内流,导致钙超载诱发细胞凋亡有关。在该信号通路中,Nox2、ROS与JNK2活化可能是相互交叉共存于NF-κB信号通路的上游。给予丹参素预处理后能减轻高糖环境下H9c2细胞的缺氧再复氧损伤,可能是通过抑制Nox2/ROS/JNK2/NF-κB通路,降低TRPC6表达,减少钙离子内流,降低钙超载,从而发挥对高糖加重H9c2细胞缺氧再复氧损伤的保护作用。丹参制剂可能成为临床上防治高糖心肌缺血再灌注损伤的有效候选药物。