论文部分内容阅读
研究背景:肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是发病率最高的恶性肿瘤之一。HCC早期症状不典型,进展迅速,复发转移率高,预后极差。近年来,以手术为主的综合治疗很大程度地改善了 HCC患者的预后,但其五年总体生存率仍不足30%。进一步揭示HCC发生发展的分子机制,开发高效特异的干预靶点,可为HCC治疗开辟新途径。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200nt的非编码RNA,通常不具备蛋白编码功能。lncRNA是RNA聚合酶Ⅱ的副产物,一度被当作基因转录的“噪音”。近些年的研究发现,lncRNA参与细胞增殖、分化、凋亡、上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)等过程的调控,对肿瘤的生物学行为具有显著影响。目前,在HCC中,针对lncRNA的研究多局限于lncRNA HULC、lncRNA HOTTIP、lncRNA DANCR等少数几个lncRNA。在HCC发生发展过程中,仍有大量lncRNA的功能及作用机制有待发掘。研究目的:基于芯片技术,筛选并验证在HCC和配对癌旁组织中差异表达的lncRNA,探讨其在HCC中的临床意义、转录调控、生物学功能,阐明其在HCC发生发展中的作用机制,为临床干预提供新的分子靶点。研究方法:1、应用lncRNA芯片,分析5对HCC(无血管侵犯、单发、肿瘤直径<5cm、术前未接受TACE等其它治疗)及配对癌旁组织的lncRNA表达,筛选差异表达lncRNA。2、利用qRT-PCR,在112例配对的HCC和癌旁组织样本中,验证差异表达的lncRNA(差异倍数超过2倍,p值小于0.05);将证实差异表达的lncRNA(CTC-505O3,命名为lncRNA DRHC)与各临床指标及预后进行分析;同时在HCC患者血清中检测lncRNADRHC的水平,探讨其作为HCC诊断和预后评判血清学标志物的可能性。3、通过特异性抑制剂,研究DNA甲基化、组蛋白修饰对lncRNA DRHC的转录调控;基于JASPAR数据库进行启动子预测,并用双荧光报告验证,确定调控lncRNA DRHC表达的转录因子。4、应用HCC细胞系Huh-7和SK-Hep-1进行体内外实验,使用质粒及慢病毒过表达lncRNADRHC,通过CCK-8、细胞周期实验、凋亡实验、细胞迁移实验、细胞侵袭实验及裸鼠成瘤实验研究lncRNADRHC对肿瘤细胞生物学功能的影响。5、运用表达谱芯片,寻找lncRNADRHC可能的作用通路,并用Western Blot进行验证;用特异性抑制剂阻断相应通路,观察lncRNA引起的生物学功能差异是否消除。6、运用RNApulldown和质谱技术,鉴定lncRNADRHC直接结合的蛋白,并用Western Blot进行验证;将相应蛋白敲低,进一步观察lncRNA DRHC调控的信号通路;利用生物信息学技术预测lncRNADRHC可能吸附的miRNA,并用qRT-PCR在pulldown的样品中进行验证。结果:1、与配对癌旁组织相比,发现在HCC中显著上调的lncRNA 97个,下调的lncRNA 100个,验证发现其中lncRNA DRHC在HCC中显著下调(p<0.001)。lncRNADRHC表达水平和肿瘤大小相关,和肿瘤数目、分化程度、AFP水平不存在相关性。其高表达可以预示HCC患者更好的预后。lncRNADRHC无法在血清中被检测到。2、组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理后,HCC细胞系Huh-7和SK-Hep-1中,lncRNADRHC表达水平分别增加53.4%和22.2%。组蛋白甲基转移酶PRMT5、EZH2抑制剂,DNA甲基化抑制剂,均不影响lncRNADRHC的表达。转染EGR1、FOS或GATA3过表达质粒后,双荧光报告的荧光表达水平无显著性增加。3、lncRNA DRHC抑制HCC细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT,并抑制裸鼠皮下成瘤(0.891±0.091 vs0.624±0.140,p<0.001)。表达谱芯片提示,lncRNADRHC作用于 MAPK 通路。Western Blot 发现,lncRNA DRHC 抑制 MEK1/2 和 ERK1/2磷酸化。使用MEK1/2特异性抑制剂Trametinib后,lncRNADRHC过表达组和对照组在增殖、迁移、侵袭和EMT上的差异消除。4、通过RNA pulldown和质谱,并用Western Blot验证发现,MYBBP1A可以和lncRNA DRHC结合。敲低MYBBP1A调控的转录因子c-Myb后,lncRNA DRHC过表达组和对照组ERK1/2的磷酸化水平差异消失。用miRDB预测到可能被lncRNADRHC吸附的miRNA31个,但在RNApulldown的实验组和对照组中,上述miRNA浓度无显著性差异。结论:1、相比癌旁组织,lncRNADRHC在HCC中的表达水平降低,并和肿瘤大小及预后相关,可作为接受肝脏部分切除的HCC患者的预后评判分子标记物。2、组蛋白去乙酰化水平增加是导致HCC中lncRNADRHC表达水平降低的原因之一。3、lncRNA DRHC直接结合MYBBP1A,继而通过c-Myb调控MEK/ERK通路,抑制HCC细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。