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[目的]手足口病(Hand, foot, and mouth disease,HFMD)是由肠道病毒引起的一种常见的儿童感染性疾病,临床以手掌、足部和口腔出现不同程度疱疹为主要症状,可伴随发热、咽痛及腹泻等,好发于5岁左右儿童群。相关研究显示HFMD具有春末夏初发病的季节性和爆发流行亚型及地域时空分布差异性,受温度,湿度和年龄等因素影响,主要通过消化道、呼吸道和密切接触等途径传播。病原体多数为肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A 16型(Coxsackievirus A16,CA16)及其他肠道病毒亚型群(Enterovirus, EVs) , EV71感染常可引起严重的中枢神经系统(Central nervous system,CNS)并发症,如急性脑炎(Acute encephalitis)、脑膜炎(Meningitis),脑脊髓炎(Encephalomyelitis),迟缓性麻痹(Flaccid paralysis)等。EV71型拥有A、B和C 3种基因型,而其编码质粒蛋白VP1是最具致病性的也是最重要的一种结构蛋白,其变化是EV71免疫原性的主要决定因素,可以用于病毒的鉴定和进化分析。本研究对临床HFMD的EV71型分离毒株的VP1基因测序分析,从分子水平探究HFMD的分子遗传进化变迁情况,为筛查HFMD易感人群、评估发病风险、临床防治提供科学依据。[方法]l研究对象:收集2015年1月至2016年12月期间在昆明医科大学附属延安医院临床就诊疑似HFMD患者590例,其中男性355例,女性235例,年龄0至36岁,≤5岁470例,5岁至18岁118例,≥18岁2例。疑似患者主要因手掌、足部及口腔等部位出现疱疹为首发症状或者伴随发热、腹泻等就诊于我院皮肤科及儿科等临床科室。2标本采集及保存:参照中华人民共和国卫生部发布的《手足口病预防控制指南(2008年版)》。在研究对象知情同意的原则下,采集HFMD患者发病7日内的5-8 g/份粪便标本,用于病原检测。采集后放入无菌采便管内后立即送检,不能及时检测时一 20℃以下低温冷冻保存,避免反复冻融。3 EV71型检测:采用实时荧光PCR法进行EV71病毒核酸的检测,使用肠道病毒71型(EV71)核酸检测试剂盒(荧光PCR法),试剂盒由江苏默乐生物科技有限公司提供,具体检测步骤依据试剂盒操作说明书进行。4病毒RNA提取:对EV71检测阳性病例临床粪便样本进行EV71病毒RNA提取,使用核酸提取试剂盒(柱提法),试剂盒由中山大学达安基因有限公司提供,具体操作步骤根据试剂盒操作说明书。5逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR):以提取的EV71病毒RNA为模板进行逆转录-聚合酶链反应,逆转录试剂盒由日本TaKaRa公司提供,具体操作步骤根据试剂盒操作说明书。6 PCR反应扩增VP1目的基因:针对EV71的VP1基因用Primer Premier 5.0软件自行设计特异性引物,并由北京博迈德科技发展有限公司进行引物合成,进行PCR反应扩增VP1目的基因。7 PCR产物琼脂糖电泳:将PCR扩增后产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定扩增目的基因产物情况,拍照同时做好相关实验结果记录。8 EV71型VP1基因扩增产物测序:扩增EV71型VP1目的基因后,将VP1阳性扩增产物全部外送至北京博迈德科技发展有限公司进行基因测序分析,根据测定EV71 VP1核苷酸序列,与基因库(GenBank)中EV71相关参考毒株序列进行比较鉴定,分析同源性并确定其所属基因亚型。9构建系统发育树:送检EV71毒株与GenBank中EV71相关参考毒株序列进行比较鉴定,测序结果应用DNAMAN (5.1.0.0)软件(美国LynnonBiosoft公司)进行基因序列的比对和同源性分析,具体操作按照软件使用说明书进行。另外利用 MEGA 4.0 软件(http://www.megasoftware.net/ )采用邻接法(neighbour-joining,NJ)和Kimura 2-parameter模型构建种系遗传变迁进化发育树,自展值(bootstrap)为1000, 了解VP1基因的遗传进化特征以及与国内外EV71型相关毒株之间的亲缘关系。[结果]1检出情况:2015年1月至2016年12月在昆明医科大学附属延安医院就诊的590例疑似HFMD患者中实验室检查共检出EV71型50例,检出率为8. 47%(50/590例),其中2015年检出28例,2016年检出22例。50例中≤5岁35例,5-18 岁 13 例,≥ 18 岁 2 例;男性占 64. 00%(32/50 例),女性 36. 00%(18/50例),女性患者中包括2例成人HFMD患者。2测序分析:检出的50株EV71毒株VP1基因测序分析,测序结果与GeneBank中EV71参考毒株(SequenceID: KU936121.1)进行基因序列的比对和同源性分析,其同源性为97. 96%-99. 43%,并确定送检毒株均为EV71 C4亚型。3系统发育树分析:检出的EV71毒株与北京(编号:EV71strainBJ4211 VP1)、2008 年安徽合肥(编号:EV71 isolate 1401-Luan(CHN)-08 VP1; EV71 isolate 1404-Luan(CHN)-08 VP1)以及马来西亚沙捞越州地区EV71型流行毒株(编号:EV71 isolate SB12007-SAR-03 VP1; EV71 isolate SB12278-SAR-03 VP1;EV71 isolate SB10712-SAR-03VP1)基因型共处于同一进化谱系,遗传距离较近。而与 2010 年浙江宁波(编号:EV71 strain EV71/Ningbo. CHN/001/2010)、2014年上海(编号:EV71 strain SHAPHC5251/SH/CHN/14 ; EV71 strain SHAPHC5330/SH/CHN/14) 、2014 年广东深圳(编号:EV71 isolate EV71/SZ07/CHN/2014; EV71 isolate EV71/SZ88/CHN/2014)、2013 年至 2014年浙江温州(编号:EV71 isolate EV71/P156/2013/China; EV71 isolate EV71/P654/2013/China; EV71 strain 15/EV71/Wenzhou/CHN/2014)等临床流行地区分离的EV71型毒株遗传距离较远,遗传距离为1.52。而与澳大利亚地区(编号:EV71 strain 2978-SYD-92VP1; EV71 strain 7784-SYD-90VP1; EV71 strain 1182-SYD-91 VP1; EV71 strain 6560-SYD-86 VP1)分离的 EV71 毒株遗传距离最远,遗传距离为2. 11。[结论]l同源性分析及鉴定:2015年1月至2016年12月分离出的50株EV71毒株VP1基因序列与GeneBank中EV71参考毒株Sequence ID:KU936121.1,序列同源性为97. 96%-99. 43%;均为EV71 C4亚型。2亲缘进化分析:构建亲缘关系进化树显示EV71毒株2年间未发生大的基因遗传变异,EV71毒株亲缘关系与国内北京和安徽合肥中部地区以及东南亚国家马来西亚地区EV71分离毒株遗传距离近;而与上海地区,浙江宁波、温州以及广东深圳地区毒株亲缘遗传距离为1. 52,与澳大利亚地区EV71毒株遗传距离为2. 11。