论文部分内容阅读
目的:1.建立一种基于G四链体结构比色法检测巨细胞病毒巢式PCR产物的方法,为临床检测巨细胞病毒提供一种方便快捷且廉价的方法。2.建立超分支滚环扩增检测肝衰竭抵抗控制基因的检测方法,有助于对临床检测该基因提供一种便捷的新方法。方法:1.首先设计好扩增巨细胞病毒的特异性引物,在第二次扩增用的引物的5’端添加一段悬挂序列,因此在扩增中该序列会被作为模板进行扩增形成一段特异的序列,该序列会与后来加入的分子信标结合,分子信标的发夹结构打开,形成G四链体结构,该结构具有类过氧化物酶的活性,可以直接催化底物显色。然后对实验条件进行优化并评价该方法的性能。2.建立超分支滚环扩增检测肝衰竭抵抗控制基因的检测方法,原理为:目标物突变型基因存在下,锁式探针PLP和目标基因发生特异性结合。同时使得锁式探针PLP的5’端和3’端无限接近,在E.coli DNA连接酶的作用下封闭成环,在外切酶以及Bst酶的催化作用下发生滚环扩增延伸,形成一条具有大量重复序列且与锁式探针互补的线状单链。引物2和该线状单链结合在Bst酶的催化下从其3’开始延伸,延伸产生的长链DNA则作为引物1结合的模板,在DNA聚合酶的作用下延伸并置换下游引物的延伸产物,被置换的延伸产物又可以作为互补模板,由锁式探针的滚环扩增起始引物进行延伸。最终,在溶液形成大量的长度分布不连续的双链DNA。这里,以SYBR Green I作为荧光指示剂,利用SYBR Green I可以嵌入双链DNA结构中并发光的特点,通过荧光强度的变化来测定目标DNA的含量。并对实验条件进行优化,并建立标准曲线和评价其临床效能。结果:1.建立了基于G四链体结构比色法检测巨细胞病毒的方法,并对如下实验条件进行了优化:PCR buffer优化为含有400m M Na Cl,放弃用不对称PCR来进行扩增,选用较长的悬挂端来进行实验,将比色反应的总时间优化为30min,发现G四链体结构在分子信标的5’或3’并不会影响实验结果,灵敏度可到82.1 copies/ml,特异度良好,批内CV=5.41%,批间CV=5.62%。取20例经过实时荧光定量PCR检测后结果为阳性的标本与该方法进行比对,结果100%相符。2.建立了超分支滚环扩增检测肝衰竭抵抗控制基因的检测方法,并对其可行性进行分析,反应条件进行了优化:选择3U E.coli连接酶浓度,1μM的PLP,1U的Bst DNA聚合酶进行实验。绘制了标准曲线Y=0.61X+508.11,R=0.99985,其灵敏度为0.05 nmol/L,并可以有效的分辨单碱基的突变表明特异度较好,批内CV=4.03%,批间CV=3.71%表明重复性良好。结论:建立了基于G四链体结构比色法检测巨细胞病毒巢式PCR产物的方法和超分支滚环扩增检测肝衰竭抵抗控制基因的检测方法,并对两种方法的实验条件进行了优化。所建立的这两种方法灵敏度,特异度,重复性均较好,有望在临床进行应用并有助于为今后进一步开展核酸恒温扩增目视法检测疾病基因或碱基突变打下实验基础。