论文部分内容阅读
我国前列腺癌的发病率逐年上升,晚期病人占比较多,经内分泌治疗后发展为激素抵抗型前列腺癌的病例越来越多。目前治疗激素抵抗型前列腺癌的常见治疗方法是以紫杉醇类为基础的化疗,然而许多激素抵抗型前列腺癌的病人在使用这种治疗方案会出现进展,且在3年之内死亡,说明激素抵抗型前列腺癌没有很好的治疗方法。有研究表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合化疗或者放疗有可能成为一种的治疗肿瘤的方法。联合使用紫杉醇类和组蛋白去乙酰化酶抑制剂治疗激素抵抗型前列腺癌也可能是具有优势的抗肿瘤方案。所以研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂的抗前列腺癌的机理很有意义。本文通过三部分实验初步研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)对激素抵抗型前列腺癌细胞DU-145、PC-3凋亡的Akt/Fox03a信号通路。第一部分SAHA对前列腺癌DU-145、PC-3增殖、生长力和凋亡的影响方法:使用不同浓度的SAHA对DU-145、PC-3细胞进行实验,DU-145用0、1、2、4、8、16、32μM处理,PC-3用0、0.25、0.5、1、5、10、15μM 处理,MT法测SAHA对细胞DU-145、PC-3活力的影响。PI染色、Annexin-V-FITC/PI染色后用流式细胞仪检测SAHA对前列腺癌细胞周期以及凋亡的影响。结果:根据MTT计算得到的IC50值,选择不同的浓度进行后续实验。DU145细胞干预浓度是1,3,9u M,PC-3细胞干预浓度是0.5,2,8μM。随SAHA浓度增高sub-GO/Gl期肿瘤细胞的增多有统计学意义(P<0.05);G2/M期细胞比例升高且有统计学意义(P<0.05)。随SAHA浓度增高细胞凋亡比例增高且有统计学意义(P<0.05)。第二部分SAHA通过Akt/Fox03a通路诱导前列腺癌细胞DU-145、PC-3凋亡方法:选用不同浓度SAHA进行实验。DU145细胞干预浓度是1,3,9 μ M,PC-3细胞干预浓度是0.5,2,8 μM。使用Western blot检测DU145和PC-3 中 cyclin A2、cyclin B、pAkt、pFox03a、Bim、Bcl-2、Bax和survivin的表达水平,qRT-PCR检测 Bim和Fas-L的mRNA表达水平。使用siRNA沉默DU145和PC-3两株细胞中Fox03a的表达,通过Western blot分析沉默后FoxO3a,Bim,Bcl-2,Bax和survivin表达水平。结果:在DU145和PC-3细胞中,SAHA降低cyclin B、cyclin A2、pAkt、pFoxO3a、Bcl-2、survivin的表达水平与对照组比有统计学意义(P<0.05),SAHA升高Bim、Bax的表达水平与对照组比有统计学意义(P<0.05),qRT-PCR的结果Bim和Fas-L的mRNA表达水平显著增加较正常对照组比有统计学意义(P<0.05)。在DU145和PC-3细胞中,si-FoxO3a成功降低FoxO3a的蛋白表达与对照组比有统计学意义(P<0.05),FOxxO3a表达水平下降后,SAHA对Bcl-2家族蛋白和Survivin的影响被部分消除。与对照组相比si-FoxO3a可以部分恢复Bcl-2和Survivin的表达,同时可以降低的Bim和Bax的表达水平,沉默Fox03a后Bcl-2/Bax比值增大且与对照组比有统计学意义(P<0.05)。第三部分SAHA与多西紫杉醇联合对前列腺癌细胞DU-145、PC-3凋亡的影响方法:将DU145细胞分为三组进行后续实验,分别是选用生理盐水组(control)、多西紫杉醇(DT)组、多西紫杉醇(DT)+SAHA(3μ M);将PC-3细胞分为三组进行后续实验,分别是选用生理盐水组(control)、多西紫杉醇(DT)组、多西紫杉醇(DT)+ SAHA(2 μM);多西紫杉醇浓度为100 nmol/L,干预培养时间为48小时,用MTT法检测SAHA、多西紫杉醇(DT)对前列腺癌细胞活力的影响,Annexin-V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡。结果:DU-145细胞结果显示与对照组相比DT组细胞活力明显下降且凋亡增加有统计学意义(P<0.05),DT组与DT+SAHA组相比DT+SAHA组细胞活力明显下降且凋亡增加差异有统计学意义(P<0.05);PC-3的结果显示与对照组相比DT组细胞凋亡比明显上升且凋亡增加有统计学意义(P<0.05);DT组与DT+SAHA组相比DT+SAHA组细胞凋亡比明显升高且凋亡增加差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1、SAHA抑制DU-145和PC-3细胞的活力,SAHA诱导DU-145和PC-3细胞的细胞周期阻滞在G2/M期,且呈剂量依赖性;2、SAHA诱导DU-145和PC-3细胞凋亡;3、SAHA可能通过Akt/FoxO3a通路诱导前列腺癌细胞凋亡;4、SAHA可以增强多西紫杉醇抑制DU-145和PC-3细胞增殖,诱导DU-145和PC-3细胞凋亡。