研究背景脓毒症通常是指感染并发全身炎症反应综合征而造成机体一系列病理改变的疾病状态,是一种失控的、严重的、持久的、全身性的炎症反应,严重者可引起多器官功能衰竭(Multiple Organ Failure,MOF)[1]。脓毒症作为急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)的主要诱发因素,在危重病人中造成约50%患者发生AKI。肾脏作为最易受到累及的器官之一,一旦受累常提示预后不良,尽管抗感染治疗及器官功能支持等技术取得了长足的进步,脓毒症急性肾损伤的病死率仍居高不下,部分原因是由于对AKI发病机理的理解不足。充分的证据表明凋亡和炎症是脓毒症诱发AKI的病理生理学中更关键的参与者,而不是单纯坏死[2]。在脓毒症期间,来自细菌产物以及免疫细胞释放的炎症介质,如脂多糖(Lipoposaccharide,LPS)和细胞因子,可以引导免疫系统抵抗感染,并且可能潜在地损害肾功能[3]。LPS是革兰氏阴性细菌的主要细胞壁成分,有助于产生炎症反应,并且可以在整个感染过程中以低水平不断释放白细胞[4]。越来越多的证据表明LPS与脓毒性AKI的发病机制有关[5,6]。最近,LPS已被广泛用作脓毒症诱导AKI的模型。另外,已有研究发现,LPS还可引起机体氧化应激损伤[7]。肾小管上皮细胞对缺血缺氧、中毒、脓毒血症等损伤因素非常敏感,是急性肾损伤时最容易受到损害因素攻击的靶目标。目前认为氧化应激(OxidativeStress,OS)可能在脓毒血症肾小管上皮细胞损伤中起了关键作用,脓毒血症时产生的过量氧自由基通过对核酸、脂质、蛋白质等大分子物质的过氧化作用可直接诱发肾小管上皮细胞凋亡,最终引发肾功能损伤。外源性的抗氧化剂不一定能够降低氧化应激,有时反而升高氧化应激而造成机体的进一步损伤,有内源性抗氧化应激保护作用的核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)通路对内毒素性AKI肾脏的保护引起了人们的高度重视。生理条件下,Nrf2在体内处于一种低浓度非活性状态,而且极易被泛素化降解,细胞接头蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)与Nrf2紧密结合,使Nrf2限制在细胞质中,无法进入细胞核,其转录活性被抑制。只有在内外界自由基和化学物质刺激时,氧化剂或亲电子化合物使Keap1的构象发生改变,或者Nrf2直接被磷酸化。Nrf2与Keap1解偶联,活化的Nrf2进入细胞核,与ARE结合,启动下游的一系列保护基因如Ⅱ相解毒酶基因、抗氧化基因等或抗氧化蛋白的表达,从而抵抗内外界氧化和化学等因素的刺激,恢复并维持内环境的稳定[8]。Nrf2作为细胞内有效的、广谱的抗氧化系统的关键调节因子,可以大大增强细胞的抗炎、抗氧化应激、抗理化损伤和抗癌能力。当Nrf2存在缺失或活性受到抑制,无法表达时,其机体保护作用明显减弱,细胞极易遭受炎症因子、氧化剂、理化因素和致癌物等损伤[9]。Nrf2通路对内毒素性AKI肾脏的保护研究相对较少,研究表明,在Nrf2敲除的小鼠中,正常情况和诱导情况下的Ⅱ相酶水平如谷胱甘肽-S-转移酶(glu-tathione-S-transferses,GST)、NAD(P)H 醌氧化还原酶 1(NAD(P)H:quinine oxidoreductase 1,NQO1)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-Glutamyl cysteine synthetase,γ-GCS)显著减少[10]。敲除Nrf2的实验大鼠,炎症反应加重,更易发生脓毒症性腹膜炎和内毒素休克,死亡率较高[11]。目前在糖尿病肾病、肾脏缺血再灌注、造影剂肾病、药物性肾损伤等方面均发现,Nrf2信号通路的的激活可以减轻肾脏损伤,保护肾功能[12.13]。其中丝裂酶原激活蛋白激酶(Mitogen-Actived Ptotein Kinasees,MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)、蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)等信号通路分子广泛参与了Nrf2的活化和核转位过程。其中PI3K/AKT通路研究较多,PI3K是一种脂激酶,分布与在体内多种细胞。PI3K激活后,可磷酸化质膜上的4.5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2),生成3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3),激活其下游靶激酶Akt[14]。Akt参与机体多种重要生理过程,可以调控细胞的增殖与凋亡,生长与存活等,除此之外它还参与了Nrf2的磷酸化,只有磷酸化的Nrf2才能与Keapl蛋白分离,然后由胞浆进入胞核中,这是Nrf2活化的重要过程,Nrf2活化后才能启动下游的抗氧化相关基因转录,发挥机体抗氧化的作用。促红细胞生成素衍生肽(helixBsurfacepeptide,HBSP)是最新的促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)类似物衍生肽,能独立于促红作用位点,既保留EPO的活性又无EPO的不良反应。临床主要用于肾性贫血的EPO近年来被证明对脑、心脏以及肾脏等脏器的缺血再灌注损伤具有保护作用。Aoshiba[15]于2009年新近发表的一项研究结果显示EPO用于LPS诱导的内毒素小鼠,可降低死亡率,对肝、脾、淋巴、肺具有保护作用。EPO的多器官保护作用与其抗氧化作用有关,应用EPO可抑制脂质过氧化,体内的抗氧化物质如过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性增强,其中PI3K/AKT通路受到广泛关注。2011年,Talan[16]等通过体外实验及大鼠心肌缺血模型比较了EPO与HBSP同类多肽对心功能的保护作用以及对氧化应激的影响,结果发现HBSP能减小梗死面积,维持心室结构,并显著提高氧自由基ROS的释放阈值,具有与EPO同样的保护效果。然而,EPO及其衍生物对于LPS诱导的肾脏损伤的作用仍不清楚。考虑到脓毒症AKI的发病正是由于炎症介质、细胞凋亡、氧化应激等多种原因所致,所以可以设想EPO衍生肽HBSP可能对脓毒症AKI具有保护作用。我们应用LPS作用于HK-2细胞作为脓毒性AKI的细胞模型,应用LPS建立大鼠内毒素血症导致肾脏损伤动物模型,从体外实验及在体实验两方面测试HBSP的抗氧化活性,并探索潜在的细胞内信号传导机制。本课题分为三部分,第一部分通过体外培养HK-2细胞,给予不同干预,观察研究HBSP对LPS诱导的HK-2细胞凋亡及氧化应激的影响,为HBSP防治内毒素引起的肾脏损伤提供初步依据。第二部分:从固有的抗氧化通路PI3K-Akt和Nrf2通路探讨HBSP肾脏保护机制,为HBSP防治内毒素引起的肾脏损伤提供更充分的依据。第三部分:建立大鼠内毒素血症肾脏损伤模型,进一步证实促红细胞生成素衍生肽(HBSP)对肾脏损伤的保护作用及可能机制。这项研究将有助于我们更好地了解脓毒症急性肾损伤的发病机制,并可能有助于发现脓毒症急性肾损伤更有效的预防和治疗策略。第一部分:促红细胞生成素衍生肽(HBSP)对脂多糖诱导的人近端肾小管上皮细胞氧化应激损伤的影响研究目的1、观察不同浓度脂多糖(LPS)对人近端肾小管上皮细胞活力及凋亡的影响。2、观察不同浓度促红细胞生成素衍生肽(HBSP)对脂多糖诱导的人近端肾小管上皮细胞活力及凋亡的影响。3、探讨促红细胞生成素衍生肽(HBSP)对脂多糖诱导的人近端肾小管上皮细胞氧化应激的影响。研究方法1、体外培养人近端肾小管上皮细胞系(HK-2),应用不同浓度的脂多糖(LPS)(0,10,100,500,1000,10000ng/ml)温育细胞24小时,采用MTT比色法测定细胞存活率,采用Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪技术检测HK-2细胞凋亡率,从而研究LPS对HK-2细胞的损伤作用,选择下一步实验中的LPS合适浓度。2、应用不同浓度的HBSP(0,10,25,50,125ng/ml)预处理HK-2细胞2小时,随后给予500ng/ml LPS,采用MTT比色法测定细胞存活率,Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪技术检测HK-2细胞凋亡率,评价HBSP对LPS诱导的细胞损伤的保护作用,选择下一步实验中HBSP的合适浓度。3、将采取不同干预措施的细胞分为4组,阴性对照组、HBSP组、LPS组、HBSP+LPS组,HBSP+LPS组先给予50ng/ml HBSP预孵育HK-2细胞2小时,随后用500ng/ml LPS预温育24小时,然后将细胞在新鲜培养基中孵育24小时。应用双乙酰基二氯荧光素(DCFH-DA)荧光探针测ROS含量,硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量以研究HBSP对LPS诱导的HK-2细胞氧化应激的影响。研究结果1、不同浓度LPS作用于HK-2细胞,各组细胞活性(图1A)分别为(84.1±0.7)%、(82.6±1.5)%、61.9±0.6)%、(53.7±0.8)%、(40.7±0.9)%、(37.3±1.9)%。100,500,1000,10000ng/mlLPS组与对照组相比,细胞活力明显降低,具有显著性差异,具有统计学意义(P<0.05)。各组细胞凋亡率(图表1B和1C)分别为(4.87± 1.29)%、(14.01±2.27)%、(39.58±3.12)%、(51.03±4.32)%、(60.9±5.64)%、(89.12±7.18)%,100,500,1000,10000ngmlLPS组与对照组相比,均有显著性差异,具有统计学意义(P<0.05)。2、不同浓度HBSP预处理HK-2细胞2小时,随后再给予500ng/ml的LPS作用24小时,并检测细胞活力及凋亡。各组细胞活性(图2A)分别为(83.5±1.0)%、(51.5±1.4)%、(56.9±0.6)%、(60.9±0.9)%、(73.0±0.9)%、(74.2±1.5)%。50,125ng/mlHBSP组与LPS组相比,细胞活力明显升高,有显著性差异,具有统计学意义(P<0.05)。细胞凋亡率(图2B和2C)分别为(2.60±0.42)%、(45.82±5.14)%、(36.53±4.61)%、(25.543.89)%、(18.97±2.92)%、(17.73±1.98)%。25,50,125ng/mlHBSP组与LPS组相比,细胞凋亡率明显下降,有显著性差异,具有统计学意义(P<0.05)。3、HK-2分为阴性对照组、HBSP组、LPS组、HBSP+LPS组,各组的ROS(图2D)分别为(15.75±0.29)%、(9.94±0.38)%、(105.88±6.17)%、(31.58±1.18)%,与LPS组相比,HBSP+LPS组ROS明显降低,有显著性差异,具有统计学意义(P<0.05)。4、HK-2分为阴性对照组、HBSP组、LPS组、HBSP+LPS组,各组的MDA(图2E)分别为(4.62±0.36)%、(4.05±0.24)%、(13.96±0.59)%、(7.14±0.50)%。与LPS组相比,HBSP+LPS组MDA明显降低,有显著性差异,具有统计学意义(P<0.05)。结论1、LPS可以以剂量依赖的方式降低HK-2细胞活力,增加凋亡,加入HBSP后HK-2细胞活性增加,凋亡减少。2、LPS可引起HK-2细胞内ROS、MDA明显升高,引起氧化应激损伤,给予HBSP预处理后ROS、MDA明显降低,氧化应激损伤减轻。第二部分:HBSP对脂多糖诱导的人近端肾小管上皮细胞PI3K-Akt和Nrf2通路的影响研究目的1、观察PI3K抑制剂LY294002对HBSP作用的人近端肾小管上皮细胞保护作用的影响。2、从固有的抗氧化通路PI3K-Akt和Nrf2通路探讨HBSP抗氧化应激的机制,为HBSP防治内毒素引起的肾脏损伤提供依据。研究方法1、体外培养人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)分为(1)空白对照组(2)溶剂对照组(DMSO组)(3)HBSP干预组(4)LPS干预组(5)LPS+HBSP干预组(6)LPS+ 25μmol/L LY294002干预组(7)LPS+HBSP+ 25μmol/LLY294002干预组,采用MTT比色法测定细胞存活率,Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪技术检测肾小管上皮细胞凋亡率,Western-blotting法检测空白对照组、HBSP干预组、LPS干预组、LPS+HBSP干预组、LPS+25μmol/LLY294002干预组、LPS+HBSP+25μmol/LLY294002干预组6组细胞总AKT、P-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1 的表达。2、体外培养人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)分为(1)阴性对照组(2)con siRNA组(3)Nrf2 siRNA组(4)LPS+HBSP组(5)LPS+HBSP+Nrf2 consiRNA组(6)LPS+HBSP+Nrf2siRNA组,将对数生长期细胞接种于无血清的培养基的6孔板中,按lipofectamine 2000提供的操作步骤配制A、B液并静置20min后加细胞培养板中,使siRNA的终浓度为50mol/L,转染后再换成完全培养基用于下一步。Western-blotting法检测各组细胞HO-1、NQO1的表达。研究结果1、DMSO组与空白对照组比较,HK-2细胞存活率及凋亡率无显著性差异,实验中可以排除DMSO对于细胞的损伤影响。LPS组HK-2细胞存活率较对照组明显下降,细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。HBSP+LPS组较LPS组HK-2细胞存活率明显升高,细胞凋亡率明显下降,但HBSP+LPS组中提前给予PI3K抑制剂LY294002干预后,HK-2细胞存活率较HBSP+LPS组明显下降,细胞凋亡率明显升高。2、LPS组较阴性对照组磷酸化Akt(p-Akt)有所升高,HBSP+LPS组p-Akt表达较LPS组显著增强,当用PI3K抑制剂LY294002预处理HK-2细胞后,HBSP诱导的p-Akt的较HBSP+LPS组表达明显降低。3、HBSP提前干预LPS作用下的HK-2细胞时,胞浆内Nrf2减少,胞核内Nrf2明显增加,与LPS组相比有显著性差异,应用LY294002预处理后这种作用明显减弱。4、LPS处理的HK-2细胞中抗氧化蛋白HO-1和NQ01的表达较阴性对照组水平有所增加,给予HBSP处理后HO-1和NQO1表达明显升高,应用LY294002预处理后HO-1和NQ01的蛋白表达水平出现明显下降。5、Nrf2是HO-1和NQ01的重要上游调节剂,使用Nrf2siRNA以沉默Nrf2在HK-2细胞中的表达,与LPS+HBSP+Nrf2consiRNA组及LPS+HBSP组相比,LPS+HBSP+Nr f 2s i RNA组HO-1和NQ01的表达明显降低。结论1、PI3K通路抑制剂LY294002可以显著逆转HBSP的细胞保护作用。2、HBSP可诱导Akt磷酸化,激活PI3K/Akt通路。3、PI3K/Akt信号通路介导HBSP诱导的Nrf2核转位。4、PI3K/Akt信号通路参与了HBSP诱导HO-1和NQ01的表达。5、HBSP诱导HO-1和NQO1的表达受Nrf2调控。6、HBSP通过激活PI3K/Nrf2信号通路,促进下游抗氧化蛋白HO-1和NQ01的表达,从而增加内源性抗氧化剂生成能力,缓解氧化应激,减少脓毒症肾小管氧化应激损伤及凋亡。第三部分:HBSP对脂多糖诱导的大鼠肾脏损伤的保护作用研究研究目的利用脂多糖(LPS)建立大鼠内毒素血症导致肾脏损伤模型,进一步证实促红细胞生成素衍生肽(HBSP)对脓毒症肾脏损伤的保护作用。研究方法1、30只SD大鼠随机分成3组,空白对照组、模型组(LPS组)及HBSP药物保护组(LPS+HBSP组),每组10只。LPS组和LPS + HBSP组大鼠尾静脉注射10mg/kg LPS溶液,空白对照组大鼠注射等体积的生理盐水。LPS注射30min后,HBSP药物保护组大鼠给予HBSP 60ug/Kg,空白组和LPS组给予相应量的生理盐水作为对照。2、LPS注射后24 h,乙醚麻醉后处死大鼠,全自动生化分析仪测定大鼠血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平,ELISA法检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。采用硫代巴比妥酸法测定大鼠血清及肾组织匀浆MDA。3、切取右肾,部分肾脏经10%甲醛固定,酒精干燥,石蜡包埋,切片,应用TUNEL法检测肾小管上皮细胞凋亡。4、切取左侧肾脏冻存于-80冰箱,提取总蛋白及核蛋白,Westerb blot法检测大鼠肾脏Nrf2、HO-1、NQ01、AKT、p-AKT蛋白表达。研究结果1、与对照组相比,LPS组大鼠血清尿素氮、肌酐显著增高(P<0.05);LPS+HBSP组大鼠血清尿素氮、肌酐显著高于对照组(P<0.05),但显著低于LPS组(P<0.05)。与对照组比较,LPS组及LPS+HBSP组大鼠TNF-α活性显著增强(P<0.05),LPS +HBSP组较LPS组大鼠TNF-α活性减低((P<0.05)。结果见表1。2、与对照组相比,LPS组、LPS+HBSP组血清MDA及肾脏组织MDA均显著增高(P<0.05);与LPS组比较,LPS+HBSP组血清MDA及肾脏组织显著MDA降低(P<0.05);结果见表2。3、LPS组及LPS+HBSP较对照组肾小管上皮细胞凋亡明显增加(P<0.05);与LPS组比较,LPS+HBSP组肾小管上皮细胞凋亡明显减少(P<0.05)。结果见图1。4、对照组与LPS组大鼠肾组织Nrf2及HO-1、NQ01蛋白表达无统计学差异。与对照组及LPS组比较,LPS+HBSP组大鼠肾组织Nrf2及HO-1、NQ01蛋白表达明显升高(P<0.05)。结果见图2A、图2B。5、3组大鼠肾组织AKT蛋白表达无统计学差异,对照组与LPS组大鼠肾组织p-AKT蛋白表达无统计学差异。与对照组及LPS组比较,LPS+HBSP组大鼠肾组织p-AKT蛋白表达明显升高(P<0.05)。结果见图2C。结论1、HBSP可通过增加Nrf2的表达及促进其核转位进而激活下游抗氧化基因HO-1、NQO1的表达从而减轻LPS大鼠的肾损伤。2、PI3K/AKT可能介导了HBSP的肾脏保护作用。3、HBSP有望成为脓毒症急性肾损伤的治疗新策略。