论文部分内容阅读
第一部分IL-33与ILC2在脓毒症中的变化及相关性研究目的:IL-33是IL-1家族成员,主要由损伤的内皮细胞、上皮细胞或髓系细胞分泌。IL-33作为警报分子,通过与其受体ST2相作用,调控T细胞、肥大细胞、固有淋巴细胞的功能。ILC2作为固有淋巴细胞的重要亚型,也是肺脏中数量最多的一个亚型。研究表明,IL-33是ILC2的活化因子,并且活化的ILC2参与机体免疫反应、炎症调控和组织损伤修复。然而,脓毒症中,ILC2在肺脏中的变化及其与IL-33之间的关系尚不清楚。因此,本部分研究检测脓毒症小鼠肺脏IL-33水平和ILC2数量的变化,并分析两者之间的相关性。研究方法:采用盲肠结扎穿孔(CLP)诱导小鼠脓毒症模型,以假手术(Shamsurgery,SS)小鼠作为对照组,于术后Oh、3h、6h、12h、24h、36h取小鼠肺脏和外周血等。采用荧光定量PCR法检测肺脏组织11-25、Il-33和Tslp的表达水平。采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测外周血中 IL-33 的水平。采用流式细胞术检测肺脏中ILC2细胞比例及数量。通过气管注射重组蛋白IL-25、IL-33和TSLP,检测肺脏ILC2细胞比例及数量的变化。结果:脓毒症肺脏组织中,ILC2细胞比例和数量在CLP术后12h开始增加,至术后36h仍持续增加。对照组中肺脏组织的ILC2细胞比例和数量在各时间点均不变。荧光定量PCR法检测发现脓毒症小鼠肺脏组织11-25、I1-33和Tslp表达增多,于6h达到峰值。肺脏I1-33表达增多最明显。在CLP术后3h,外周血IL-33的水平开始增加,且在术后6h到达峰值,之后在24h内下降。注射外源性IL-33能显著促进ILC2在肺脏中募集;IL-25虽能促进ILC2的募集,但募集的ILC2在数量上远不及注射IL-33后和CLP模型24h后肺组织中ILC2的数量;TSLP对肺脏ILC2的募集无明显诱导作用。结论:脓毒症早期,IL-33在循环及肺脏组织中呈高表达,随后ILC2数量在肺脏中显著增加。IL-33是促进脓毒症肺脏组织中ILC2募集的重要分子。第二部分IL-33及其受体对ILC2募集和功能的影响研究目的:基于第一部分的发现,同时,IL-33又是活化ILC2的重要因子,能够激活ILC2并且促进细胞因子释放;ILC2是Th2细胞因子IL-4、IL-9和IL-13的重要来源。那么,在脓毒症中,IL-33是否介导了 ILC2的活化和细胞因子的分泌呢?本部分研究进一步采用基因敲除小鼠验证IL-33及其受体ST2对脓毒症中肺脏ILC2的募集作用,并观察其对ILC2的活化和细胞因子分泌的影响。研究方法:在野生型(WT)、IL-33基因敲除(Il-33-/-)和ST2基因敲除(Illrl1-/-)小鼠上复制CLP模型,观察CLP24h后肺脏组织中ILC2的细胞比例和细胞数量。同时,给Il-33-/-小鼠注射重组IL-33蛋白,于24h后,取肺脏组织,采用流式细胞术检测ILC2的细胞比例和数量。采用流式细胞术检测CLP小鼠肺脏ILC2分泌各细胞因子(IL-4、IL-9和IL-13)的情况。采用ELISA法检测肺泡灌洗液和血浆中IL-9和IL-13的水平。结果:Il-33-/-和Il1rl1-/-产小鼠在CLP24h后,肺脏ILC2募集受抑制,ILC2比例和数量均不增加。在IL-33基因敲除小鼠中给予外源性重组IL-33蛋白,能够促进ILC2在肺脏中的募集,而且逆转CLP后肺脏ILC2募集受抑制的现象。WT小鼠CLP后,肺脏ILC2分泌IL-9和IL-13的细胞增加,且分别于24h和6h达到峰值,但分泌IL-4的ILC2未见显著变化。血浆IL-9和IL-13的水平在CLP后升高,并且分别于24h和12h达到峰值。而IL-33/ST2敲除小鼠CLP后肺泡灌洗液及血浆中IL-9、IL-13的浓度均降低。结论:脓毒症小鼠肺脏ILC2的募集、活化和细胞因子分泌依赖于IL-33/ST2信号通路。第三部分募集的ILC2对脓毒症的保护作用研究目的:脓毒症后血管功能紊乱是重要脏器组织炎症细胞浸润、炎症介质释放和脓毒症发展的关键环节。脓毒症可导致肺血管内皮细胞死亡继而引发血管功能紊乱。ILC2是重要的免疫调控细胞,参与肺脏组织的防御和肺上皮细胞的保护。脓毒症后释放的IL-33介导ILC2的募集,且敲除IL-33及其受体ST2后,ILC2的肺内募集受抑制,释放的细胞因子显著减少。因此,本部分探讨IL-33及其募集的ILC2在脓毒症致肺血管内皮损伤中的保护作用及具体机制。研究方法:在WT和I7-33-/-小鼠上复制CLP模型,通过EBD染色检测肺血管通透性。通过Annexin V/7-AAD染色检测肺血管内皮细胞死亡情况。ILC2与肺血管内皮细胞共培养,检测LPS/TNFα刺激后,肺血管内皮细胞死亡情况及细胞死亡类型。通过Caspase-1和TUNEL染色,明确血管内皮细胞的焦亡情况。流式细胞术和Western blot技术检测血管内皮细胞Caspase-1活化情况。气管注射IL-9抗体,检测CLP后血管内皮细胞死亡水平。结果:CLP模型24h后,Il-33-/-小鼠肺渗透性较WT小鼠显著增加,77-33-/-小鼠肺脏中EBD浓度为WT小鼠的2倍。Il-33-/-小鼠肺血管内皮细胞死亡较WT小鼠显著增加。在ILC2与内皮细胞共培养体系中,ILC2能够抑制LPS/TNFα所致的小鼠肺血管内皮细胞死亡,而IL-33不影响内皮死亡。通过LPS/TNFα刺激体外培养的Caspase-1-小鼠的肺血管内皮细胞,Annexin V/7-AAD双阳性比例下降近70%。IL-9抗体拮抗ILC2和血管内皮细胞共培养体系中的IL-9后,ILC2减轻LPS/TNFα刺激血管内皮细胞死亡的作用消失。LPS/TNFα刺激血管内皮细胞24h后,Caspase-1/TUNEL染色发现IL-9能够抑制Caspase-1的激活,抑制肺血管内皮细胞的死亡。气管注射IL-9抗体后,CLP小鼠肺血管内皮细胞死亡增加。结论:脓毒症后肺脏募集的ILC2通过分泌IL-9,抑制肺血管内皮细胞Caspase-1的活化,进而抑制肺血管内皮的细胞焦亡。