研究背景和目的和干细胞一样,肿瘤细胞也具有无限增殖和自我更新能力。肿瘤组织中存在一小部分细胞,表达干细胞标记物并具有干细胞样特性(stem-cell-like ability)，可以维持肿瘤的生长、转移和复发。最新研究发现,通过产生新的基因突变或环境因子作用可产生新的肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs),亦即肿瘤细胞可能获得新的突变而成为新的肿瘤干样细胞。在这种情况下,肿瘤细胞获得转移表型。干性相关基因(stemness associated genes),比如Sox2, KLF4, Bmil和Oct4,通常被认为可以维持胚胎干细胞的干性,最近的研究也表明这些干细胞相关基因表达在一些肿瘤中,并调控肿瘤的成瘤和转移。干性相关基因及其信号通路异常可能是肿瘤发生和转移的机制。MicroRNA(miRNA)是一类大小约为19-22个核苷酸的小分子RNA。由具有发夹结构的大小约为70-90nt的单链前体miRNA(pre-miRNA)经过Dicer酶剪切加工后生成,通过与靶基因：mRNA的3’非编码区(3’untranslated region,3’UTR)互补配对相结合介导靶基因mRNA的降解或(和)翻译抑制。越来越多的证据表明,miRNA在许多肿瘤中表达异常,并参与肿瘤的形成、生长和转移。另外。MiRNA还是肿瘤干细胞生长和转移的重要调节因子,一些miRNA与结直肠癌干细胞有着密切的联系。在结直肠癌干细胞向结直肠细胞分化的过程中miR-93表达下调并抑制结直肠癌干细胞的增殖。MiR-328可维持结直肠癌侧群(SP)细胞的干性特征。MiR-200c是miR-200家族的主要成员之一,miR-200家族可以抑制epithelial-mesenchymal transition (EMT)发生,其在肿瘤中表达下调可以促进肿瘤的侵袭和转移。MiR-200c在对肿瘤的生物学行为有着重要的作用,另外,至今为止,尚未有文献报道miR-200c参与结直肠癌干性的调节。因此我们检测miR-200c在结直肠癌中的表达及其在维持结直肠癌干性和转移中的作用。我们证实干细胞相关基因Sox2是miR-200c的靶基因,Sox2和OCT4,NANOG共同编码同源结构域蛋白并调节胚胎干细胞的早期发育。Sox2可以参与调节一些肿瘤如神经胶质瘤、胃癌和乳腺癌的成瘤和增殖。Sox2可以使前肠祖细胞向食管和胃分化,在炎症信号的刺激下可以诱导肿瘤的形成。因此,我们推测miR-200c和其靶基因可能参与调节肿瘤形成和肿瘤细胞向肿瘤干细胞转化。但是,目前尚未有文献报道miR-200c及Sox2如何调节结直肠癌的干性和转移。因此,本研究旨在探讨miR-200c-Sox2相关的信号机制如何调节结直肠癌的干性、生长和转移,为探讨结直肠癌生长、转移机理提供实验依据。研究方法1. miR-200c在结直肠癌组织及细胞中的表达采用荧光定量RT-PCR的方法检测了34例结直肠癌患者癌组织和正常肠粘膜中miR-200c的表达。检测miR-200c在SW480、SW620、HT29、Lovo和HCT1165种结直肠癌细胞株中的表达。2. miR-200c靶基因的筛选和鉴定(1)利用生物信息学在线网站TargetScan、Pictar和microRNA.org预测miR-200c的靶基因,筛选miR-200c的候选靶基因。(2)荧光定量RT-PCR检测Sox2、Bmil和KLF4mRNA在结肠癌细胞中的表达水平。荧光定量RT-PCR检测Sox2在34例结直肠癌患者癌组织和正常肠粘膜中的表达,Western bloting检测Sox2在细胞和组织中的表达。(3)扩增包含miR-200c结合位点的Sox23’UTR基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2双荧光素酶报告载体,并对Sox23’UTR上miR-200c的结合位点进行定点突变。利用荧光素酶报告系统检测miR-200c与Sox23’UTR的结合情况,明确Sox2是否为miR-200c直接作用的靶基因3. miR-200c对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响(1)利用慢病毒包装系统,制备稳定过表达miR-200c的病毒上清,将其传导至SW480和SW620细胞中,建立稳定过表达miR-200c的SW480和SW620细胞亚系。同时,制备稳定干扰miR-200c表达的病毒上清,将其传导至HCT116和SW480细胞中,建立稳定干扰miR-200c表达的HCT116和SW480细胞亚系。构建不含Sox23’UTR区的Sox2过表达重组子,并将其转染至稳定过表达miR-200c的细胞亚系中。(2)利用CCK8细胞增殖实验、平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验,检测miR-200c过表达,miR-200c/Sox2(不含3’UTR)共表达以及miR-200表达抑制对体外结直肠癌细胞增殖、克隆形成能力、迁移和侵袭能力的影响。(3)利用裸鼠皮下成瘤实验及原位种植实验检测miR-200c过表达以及miR-200c/Sox2(不含3’UTR)共表达对体内结直肠癌细胞成瘤和转移能力的影响。4. miR-200c对结直肠癌细胞干性特征的影响观察干扰miR-200c之后细胞形态的变化、肿瘤球形成能力,以及肿瘤干细胞标记物的改变。5. miR-200c-Sox2负反馈机制的证实(1)采用UCSC、TESS和TFSEARCH等生物信息数据库查找miR-200c启动子上的转录因子及结合位点。(2)构建转录因子Sox2表达载体,扩增包含Sox2结合位点的miR-200c启动子片段并克隆PGL3-Basic荧光素酶报告载体,并对结合位点进行突变得到相应的突变载体。在HEK293和SW480细胞中共转染Sox2表达载体和miR-200c启动子双荧光素酶报告载体,双荧光素酶报告实验检测转录因子Sox2对miR-200c活性的影响。(3) ChIP实验证实转录因子Sox2与miR-200c启动子的直接结合。6. miR-200c参与的结肠癌信号通路的检测利用Western blotting检测结直肠癌细胞株中miR-200c过表达,miR-200c/Sox2共表达,miR-200c表达抑制以及PI3K-AKT抑制剂处理之后T-PI3K、T-AKT、p-PI3K和p-AKT蛋白质的表达。7.统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。定量的数值用均数士标准差(standard deviation, SD)表示。组织的荧光定量PCR结果△Ct的比较采用配对样本t检验(Paired-Sample t text),癌组织中miR-200c的表达与病人临床资料的分析用Fisher’s确切检验,细胞荧光定量PCR结果2-△△Ct值、平板克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时采用Welch近似方差分析：方差齐性的多重比较采用LSD法、SNK(Student-Newman-Keuls)法,方差不齐时采用Dunnett T3法。组织和细胞中miR-200c和Sox2表达量的相关性,正态分布资料选用Pearson’s相关系数,非正态分布资料选用Spearman相关系数；双荧光素酶活性比较R/F值,方差齐性时采用两独立样本t检验(Independent-Samples t text),方差不齐时采用近似t检验。CCK8体外增殖实验采用析因设计的方差分析和单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1. miR-200c在组织和细胞中表达下调与结直肠癌的转移、分期和生长相关(1) miR-200c在结直肠癌组织中表达下调。荧光定量RT-PCR检测结果显示：在34例结直肠癌患者癌组织和正常肠粘膜中,miR-200c在癌组织中的表达低于正常粘膜组织(t=-13.758,P<0.001)。临床病理分析显示miR-200c在34例结直肠癌组织中的表达与肿瘤的大小、浆膜浸润、淋巴结转移以及TNM分期显著相关(P=0.042；P=0.016；P=0.013；P=0.002),而与患者的性别、年龄以及肿瘤分化程度均无显著关系(P=0.734；P=1.000；P=0.477)。(2) miR-200c在高转移潜能的结直肠癌细胞系中的表达下调荧光定量RT-PCR检测结果显示：在SW480、SW620、HCT116、HT29及Lovo细胞五种细胞之间,miR-200c的表达具有统计学差异(F=370.078,P<0.001)。以SW480作为参照,经Dunnett T3多重比较发现,miR-200c在SW620和Lovo细胞中的表达低于SW480(P=0.011;P=0.008),而miR-200c在HCT116和HT29细胞的表达高于SW480(P=0.007; P<0.001).因此,miR-200c在高转移潜能的结直肠癌细胞系中的表达下调。2.Sox2是miR-200c的靶基因(1)采用miRNA靶基因预测软件(TargetScan、Pictar和microRNA.org)查找miR-200c的靶基因,发现Sox2、KLF4和Bmmi1干性相关基因是miR-200c的预测靶基因。(2)荧光定量RT-PCR检测Sox2、KLF4和Bmil mRNA在SW480、SW620、 HCT116、 HT29及Lovo细胞中的表达。在这5株细胞中Sox2mRNA的表达与miR-200c的表达呈负相关关系(P<0.001,r=-0.914),而Bmi1和KLF4mRNA与miR-200c的表达负相关性不显著(P<0.001, r=-0.396; P=0.692, r=-0.112)。因此,优先选择Sox2作为miR-200c的候选靶基因。(3)荧光定量RT-PCR和Western Bloting检测Sox2在结肠癌组织中的表达,Sox2在癌组织的表达上调。相关性分析表明miR-200c与Sox2mRNA在结直肠癌组织中的表达存在负相关关系(P<0.001, r=-0.870)。(4)成功构建Wt Sox23’UTR和Mut Sox23’UTR双荧光素酶报告载体。HEK293细胞中几乎不表达miR-200c,将Wt Sox23’UTR和Mut Sox23’UTR以及pre-miR-200c或者其阴性对照(negative control) pre-miRNA共转染至HEK293细胞中。在HEK293细胞中,在miR-200c存在的情况下pSox23’UTR的荧光素酶活性下降(t=10.721,P<0.001),而Mut Sox23’UTR的荧光素酶活性无统计学差异(t=2.402,P=0.074)。此外,我们还检测内源性miR-200c对Sox23’UTR荧光素酶活性的影响。在高表达miR-200c的HCT116细胞中和miR-200c低表达的SW620细胞中转染WtSox23’UTR或者Mut Sox23’UTR,与SW620细胞相比,HCT116细胞中Wt Sox23’UTR荧光素酶活性较低(t=-48.772,P<0.001)而两株细胞中Mut Sox23’UTR的活性无统计学差异(t=-2.399,P=0.074)。这表明miR-200c可以特异的结合与Sox23’UTR。3. miR-200c抑制Sox2的表达而抑制结直肠癌细胞体内外的生长和转移(1)以空载体病毒(Control)为对照,在SW480和SW620细胞中感染miR-200c病毒,共转染miR-200c病毒和Sox2(不含其3’UTR)重组子建立相应的细胞亚系(F=679.071, P<0.001; F=129.337, P<0.001)与Control组相比,miR-200c在SW480/miR-200c和SW620/miR-200c细胞中表达升高(P=0.010;P=0.016)；在SW480/miR-200c和SW620/miR-200c细胞中感染Sox2(不含其3’UTR)重组子使Sox2的表达得到回复(P=0.010；P=0.049)同时,以Scramble为对照,在HCT116和SW480细胞中感染干扰niR-200c表达的病毒得到细胞亚系SW480/zip-200c和HCT116/zip-200c (F=694.352, P<0.001;F=22.278,P<0.001)。与Scramble相比,miR-200c在HCT116/zip-200c和SW480/zip-200c细胞中的表达下降(P=0.001；P=0.039)。在HCT116和SW480细胞中稳定过表达Sox2, Western blotting证实与对照Vector相比,Sox2转染使HCT116和SW480细胞中Sox2表达上调。(2)荧光定量RT-PCR和Western bloting检测结果表明,SW480和SW620细胞中4中不同的处理Sox2mRNA表达具有显著差异(F=231.765,P<0.001；F=32.424,P<0.001))。过表达miR-200c之后,SW480和SW620细胞中Sox2的mRNA和蛋白水平表达下调(P=0.016; P=0.034)。 HCT116和SW480细胞中3中不同的处理Sox2mRNA表达具有显著差异(F=909.923,P<0.001；F=416.705,P<0.001)),干扰miR-200c表达之后,HCT116和SW480细胞中Sox2的mRNA和蛋白水平表达上调(P=0.002；P=0.005)。表明miR-200c在转录和翻译水平上调节Sox2的表达。(3)与Vector相比,稳定过表达Sox2促进HCT116和SW480细胞的增殖能力(F=347.819,P<0.001；F=421.909,P<0.001),克隆形成能力(t=-7.303,P=0.002；t=-12.520, P<0.001),迁移(t=-23.433,P<0.001；t=-15.905,P<0.001)和侵袭能力(t=-14.053,P<0.001；t=-17.529,P<0.001)。(4)CCK-8细胞增殖实验表明：SW480和SW620细胞中各组增殖能力有显著差异(F=390.796, P<0.001；F=298.947, P<0.001)。与Control组相比,过表达miR-200c抑制SW480和SW620细胞的增殖(P=0.018；P=0.011),而miR-200c/Sox2转染组细胞增殖能力较miR-200c组显著增强(P=0.033；P=0.040)。HCT116和SW480细胞中各组增殖能力有显著差异(F=1153.728,P<0.001;F=1152.221, P<0.001)。与Scramble相比,干扰miR-200c的表达促进HCT116和SW480细胞的增殖(P=0.012；P=0.041)。平板克隆形成实验也得到相似的结果。(5)软琼脂克隆形成实验表明：SW480和SW620细胞中各组体外成瘤能力有显著差异(F=118.545, P<0.001；F=93.966, P<0.001)与Control相比,过表达miR-200c之后,SW480和SW620细胞体外成瘤能力下降(P<0.001；P<0.001),而共表达miR-200c/Sox2之后SW480和SW620细胞的体外成瘤能力得到回复(P<0.001；P<0.001)。HCT116和SW480细胞中各组体外成瘤能力有显著差异(F=308.547,P<0.001；F=198.962,P<0.001)。与Scramble相比,表达miR-200c之后,HCT116和SW480细胞的体外成瘤能力增强(P<0.001：P<0.001)。(6) Transwell迁移实验表明：SW480和SW620细胞中各组体外迁移能力有显著差异(F=36.940, P<0.001；F=10.633, P<0.001)。与Control相比,过表达miR-200c之后,SW480和SW620细胞迁移能力下降(P<0.001；P<0.001),而共表达]miR-200c/Sox2之后SW480和SW620细胞的迁移能力得到回复(P<0.001; P=0.001)。 HCT116和SW480细胞中各组体外迁移能力有显著差异(F=752.646, P<0.001；F=1155.157, P<0.001)。与Scramble相比,干扰miR-200c之后,HCT116和SW480细胞迁移能力增强(P<0.001；P<0.001)。Transwell侵袭实验也得到相似的结果。(7)裸鼠皮下成瘤实验显示：SW620/Contro1。SW620/miR-200c和SW620/miR-200c/Sox23组皮下瘤体积有显著差异(F=29.000,P<0.001)与Control组相比,miR-200c组皮下肿瘤体积较小(P<0.001)；而miR-200c/Sox2组皮下肿瘤体积较miR-200c组的大(P<0.001)。皮下瘤免疫组化染色表明,与Control组相比,皮下瘤组织中靶基因Sox2,增殖指数Ki-67和肿瘤干细胞标记物β-catenin、CD133和CD44在miR-200c组表达下调(P<0.001；P=0.013；P<0.001；P<0.001；P<0.001)。而Sox2、Ki-67、β-cantenin、CD133和CD44在miR-200c/Sox2组中的表达较miR-200c组的高(P<0.001；P<<0.001；P<<0.001;P<0.001；P<0.001)。(8)裸鼠盲肠原位移植实验显示,SW620/Control组与SW620/miR-200c/Sox2组中各有3/5的小鼠发生肝转移,而在SW620/miR-200c组中无裸鼠发生肝转移。镜下计数肝转移结节,结果显示3组肝转移结节数目有显著差异(F=55.300,P<0.001),在其他脏器中均未发现转移结节。4. miR-200c表达缺失使结直肠癌细胞获得干性特征在HCT116和SW480细胞中干扰miR-200c的表达之后,细胞发生逆向干细胞分化,表现为细胞由梭型变成圆形。而且干扰miR-200c之后,肿瘤球形成能力增强。Western blotting结果表明,干扰miR-200c的表达之后,HCT116和SW480细胞中干细胞标记物CD133和β-catenin表达上调。荧光定量RT-PCR结果表明β-catenin. CD133和CD166在HCT116和SW480细胞的各处理组中表达有显著差异(F=145.631, P<0.001; F=855.525, P<0.001; F=2255.786,P<0.001)(F=1369.619, P<0.001; F=764.232, P<0.001; F=455.840, P<0.001)。在HCT116细胞中,和Scramble组相比,β-catenin、CD133和CD166在zip-200c组中的表达上调(P<0.001,P<0.001,P<0.001),在SW480细胞中也得到相似的结果(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。5. miR-200c-Sox2通过负反馈机制相互调节(1)在HCT116和SW480细胞中Sox2过表达之后,miR-200c表达下调(t=10.335, P=0.009; t=29.643, P=0.001).(2)采用启动子和转录因子预测软件UCSC、TESS和TFSEARCH等分析,发现miR-200c启动子上存在两个Sox2转录因子结合位点,分别命名为A和B。(3)扩增miR-200c启动子上包含Sox2结合位点的片段,并克隆至PGL3-Basic荧光素酶报告载体构建PGL3-Wt-Luc,并将Sox2结合位点进行突变,分别构建突变荧光素酶报告载体PGL3-Mut-LucA, PGL3-Mut-LucB和PGL3-Mut-LucAB。分别将这些载体与Sox2表达载体共转染至HEK293和SW480细胞中,检测其荧光素酶活性。4种荧光素酶报告载体的活性在HEK293和SW480细胞中有显著差异(F=113.374,P<0.001;F=75.340,P<0.001)。在HEK293细胞中,与对照pGL3-Basic相比,Sox2可以降低pGL3-WT-Luc和pGL3-Mut-LucB的荧光素酶活性(P<0.001；P<0.001),而不改变pGL3-Mut-LucA和pGL3-Mut-LucAB荧光素酶活性(P=0.337;P=0.191)；在SW480细胞中,与对照pGL3-Basic相比,Sox2可以降低pGL3-WT-Luc和pGL3-Mut-LucB的荧光素酶活性(P<0.001P<0.001),而不改变pGL3-Mut-LucA和pGL3-Mut-LucAB荧光素酶活性(P=0.089; P=0.171)。ChIP实验表明,Sox2可以直接结合于miR-200c的A位点。因此,miR-200c-Sox2负反馈调节机制调控结直肠癌细胞细胞的干性,生长和转移。6. miR-200c调节结直肠癌信号通路的初步探讨(1) Western blotting结果显示,和Blank, Control相比, p-PI3K和p-AKT在SW480/miR-200c和SW620/miR-200c细胞中的活性下降,而在miR-200c和Sox2共表达的SW480和SW620细胞中p-PI3K和p-AKT.而总蛋白量T-PI3K和T-AKT在4组间无显著差异。(2) Western blotting结果显示,和Blank, Scramble相比, p-PI3K和p-AKT在SW480/zip-200c和HCT116/zip-200c细胞中的表达较高,用LY294002抑制剂处理,使p-PI3K和p-AKT的活性降低。以上结果表明,miR-200c可以抑制P-PI3K和p-AKT的活性。即miR-200c靶向Sox2抑制PI3K-AKT通路调节结直肠癌细胞细胞的干性,生长和转移。结论1.miR-200c在结肠癌组织中表达下调,与结肠癌的淋巴结转移、分期和肿瘤大小相关；miR-200c在具有高转移能力的细胞中表达下调；初步推断miR-200c在结肠癌组织中miR-200c发挥抑癌的作用。2.Sox2是miR-200c的靶基因,miR-200c抑制Sox2的表达而抑制结直肠癌细胞的生长,成瘤和转移能力。3.miR-200c表达缺失使结直肠癌细胞获得干性特征。4.miR-200c-Sox2负反馈调节机制调控结直肠癌细胞细胞的干性,生长和转移。5.miR-200c抑制P-PI3K和p-AKT的活性而调节结直肠癌细胞的生长,成瘤和转移能力和干性。