背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)又称老年性痴呆,是一种以记忆力减退、认知功能障碍为特征的中枢神经系统慢性退行性疾病,病情呈进行性加重。AD的主要病理特征是老年斑、神经原纤维缠结、淀粉样血管病、颗粒空泡变性和大脑神经元细胞丢失。研究发现,在65岁以上的患者中,AD女性患者的发病率为同龄男性的3倍。这可能与女性绝经期后雌激素水平减少及雌激素受体(ER)通路改变相关。目前,对AD还没有有效的治疗方法。临床发现单一靶点药物药效局限且往往毒副作用比较大,于是逐渐转向多药物多靶点的联合用药,以提高疗效,减轻毒副作用。传统中医药具有多成分多靶点的作用特点,随着大数据时代的到来和多学科交叉的快速发展,给中药的研究和临床应用提供了新的思路。中药复方柴胡疏肝散(CSS)出自《景岳全书》,内含柴胡、香附、川芎、枳壳、芍药、陈皮和甘草七味中药。临床广泛用于治疗胃肠疾病、妇科疾病和精神神经系统疾病,疗效确切。其成分复杂,作用机制不明。本课题拟通过柴胡疏肝散对APP/PS1阿尔茨海默病转基因小鼠认知和学习记忆行为的影响,采用现代的技术和方法从药理学、药效学以及肠道微生物的角度阐述柴胡疏肝散的药物药效成分和作用机制。为柴胡疏肝散的药物质量控制、制剂加工和临床应用提供理论基础。方法:首先,选用4月龄雄性APP/PS1转基因小鼠,随机分为模型组(V)、柴胡疏肝散高剂量组(H,1.4g/kg)、低剂量组(L,0.7g/kg)和西药安理申(A,2mg/kg)及同窝阴性对照组(C)。每天灌胃给药一次,连续给药8周。采用新物体识别和水迷宫行为学检测柴胡疏肝散对小鼠认知和学习记忆的影响。免疫组化检测APP/PS1小鼠脑内老年斑沉积量和雌激素受体表达量。ELISA检测小鼠脑内海马和皮层雌激素含量。对实验小鼠粪便16sRNA基因V3-V4区做高通量测序,检测肠道微生物菌群变化。核磁质谱体外检测脑内NAA、Cr、Cho、Tau等生化指标;检测肝肾功能评价指标。探讨柴胡疏肝散改善APP/PS1小鼠认知和学习能力的作用与机制。然后,构建UFLC-MS/MS联用法,检测蒸汽提取和超声提取两种不同提取方法制备的柴胡疏肝散化学成分及其质量,明确柴胡疏肝散中药效化学成分,建立一个高效、准确的质量检测手段。为柴胡疏肝散药材质量控制提供新方法。最后,依据网络药理学方法,通过数据库分析,筛选柴胡疏肝散中符合口服利用度和类药性规则的药效成分,构建成分-靶点网络,查找柴胡疏肝散药效成分作用靶点。利用DAVID数据库建立靶点与疾病AD疾病网络,查找AD疾病相关靶点和通路。使用STRING数据库建立靶点之间的联系,用Cytoscape3.2.0分析软件,建立成分-靶点的关联网络。阐释柴胡疏肝散药效成分对AD的作用机制。结果:行为学实验结果表明柴胡疏肝散和安理申能显著改善APP/PS1模型小鼠学习和记忆能力。柴胡疏肝散能减少脑内老年斑的沉积,增加小鼠脑内雌激素含量和增加雌激素受体ERβ表达量。核磁质谱显示脑内生化指标没有差异改变。肝肾功指标表明柴胡疏肝散的使用剂量对APP/PS1小鼠没有显著影响。肠道菌群测序结果发现,与野生组相比,模型组小鼠的肠道菌群梭菌属(Clostridium)、厚壁菌门中的罗氏菌属(Roseburia,属于毛螺菌科)、Oscillospira、Prevotella、拟杆菌属(Butyricicoccus)均显著降低。在种(Species)水平上,与模型组相比,出现拟杆菌属的一种产丁酸菌(pullicaecorum)在高、低剂量组、野生组和安理申组均显著升高。分析结果表明,模型组与野生组相比,小鼠出现了菌群丰度和多样性改变,在药物干预后,可以逆转模型小鼠菌群的变化。推断柴胡疏肝散可以改变APP/PS1小鼠肠道菌群。UFLC-MS/MS质谱联用技术结果显示,该技术对柴胡疏肝散成分和质量检测效率高,速度快。结果发现水蒸气提取法制备的柴胡疏肝散样品芍药苷和没食子酸甲酯含量比超声提取法高1.5倍,蒸汽提取法制备的样品中,柴胡的主要成是柴胡皂甙B1和B2,而超声提取样品中柴胡D的含量更高。柴胡疏肝散七味中药已报道的化学成分有670种,符合口服利用度和类药性筛选条件的有40种,我们的质谱分析结果发现的17种化学成分中有8种满足网络药理学筛选条件。分别将上述40种和8种成分构建成分-靶点网络,结果显示柴胡疏肝散成分槲皮素的作用靶点最多,有384个;在柴胡疏肝散40种成分中有17种作用于ERα/β靶点,且其对应的AD靶点中网络度最好的是CASP3;在柴胡疏肝散复方的8种成分对应AD相关的25个靶点网络特征结果显示,CASP3依然是网络度最好的靶点,其次为MAPK1、MAPK3、CASP7、CASP8 和 FAS 等。结论:柴胡疏肝散可能通过调节脑内雌激素及其受体通路改善APP/PS1转基因小鼠认知功能。同时柴胡疏肝散可以改变APP/PS1小鼠的肠道菌群。另外,网络药理学的结果提示柴胡疏肝散也可能通过CASP3和FAS等靶点对AD发挥治疗作用。以上结果为柴胡疏肝散的基础研究和临床应用提供理论依据。