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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是危害养猪业最严重的病原体之一,每年给全球养猪行业造成巨大的经济损失,至今无有效的药物。2006年,我国爆发了高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV),其毒力增强与RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp,nsp9)和解旋酶(Helicase,nsp10)的变异有关,但具体的分子机制尚不清楚。此外nsp9与nsp10是PRRSV复制转录复合体(RTC)最重要的组成部分,但其参与复制的分子机制仍未阐明。本研究通过晶体学方法解析了动脉炎病毒科PRRSV解旋酶的首个全长结构,揭示了一种1B结构域走向不同的全新构象,并首次展示了C末端结构域的三维构象。进一步通过生化实验验证了1B结构域在解旋酶与核酸底物结合过程中发挥着重要的作用,及C末端结构域对ATPase活性具有重要影响。本研究为阐释nsp10参与病毒复制的分子机制及药物设计提供了新思路。具体工作内容如下:1.PRRSV nsp10结构解析。原核表达纯化PRRSV nsp10可溶性蛋白,通过晶体初筛及优化获得了高分辨率的晶体,并利用X-Ray衍射收集收据并解析了分辨率为3.0?的晶体结构。PRRSV nsp10是由三个结构域组成的单体:N端锌指结构域(ZBD)、非特征性1B结构域及C端解旋酶核心结构域。我们发现PRRSV nsp10 1B结构域走向与其他解旋酶不同,将其与已有结构的SF1家族解旋酶进行比较发现1B极具柔性且其在序列和结构上的位置也有较大的变动,它并非是解旋酶必须存在的结构域。我们从结构上揭示了PRRSV nsp10 1B结构域走向不同的原因在于1B上第126位亮氨酸(L)和第128位苏氨酸(T)分别与ZBD上第19位丙氨酸(A)和第20位半胱氨酸(C)及1A结构上第129位半胱氨酸(C)形成了氢键作用力。另外本文首次展示了动脉炎病毒科解旋酶C末端结构域是由三个β-sheet和两个相互垂直的α-helix组成,该规整性结构提示了该区域在行使功能过程中可能发挥着重要作用。2.PRRSV nsp10 1B结构域与C末端结构域的功能研究。为了研究1B结构域与C末端结构域与功能的关系,我们构建了nsp10Δ1B、nsp10 1-389重组质粒,并纯化了相应可溶性蛋白。首先利用EMSA方法检测了nsp10Δ1B蛋白与dsDNA和dsRNA的结合力,结果表明nsp10Δ1B与dsDNA结合力相比于野生型蛋白降低了约50%;ATPase活性虽有所减弱但不会完全丧失;Helicase活性检测结果表明1B缺失蛋白与野生型蛋白不存在显著性差异,揭示了1B结构域主要功能是与核酸底物的结合。同样,为了研究nsp10 C末端结构域与功能的关系,我们检测nsp10 1-389蛋白的ATPase和Helicase活性,结果表明C末端结构域的缺失完全丧失了ATPase的活性,但解旋功能几乎不受影响。说明PRRSV nsp10 C末端结构是ATPase活性发挥的必要组件。