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目的:外泌体是由细胞膜两次内陷形成的直径约40-120nm的囊泡,是体内细胞-细胞之间通讯及物质交换的重要途径。外泌体避免了其它传统基因运送载体(质粒、病毒、脂质体等)的诸多缺陷:如载体毒性,失靶现象,低效基因运送,体内快速清除,生物半衰期短,引起炎症、免疫反应,致瘤性等。外泌体具有天然、稳定、良好的生物分布、相容性、及低免疫源性等特性。此外,外泌体可穿过生物屏障并能够携带单一或随意组合的治剂等优点。天然未经修饰的外泌体经系统给药后,会优先分布于肝、肾、脾等器官而被很快清除。利用基因工程可以将归巢肽展示在外泌体表面,从而增加外泌体在体内的滞留时间,加速所携带药物向靶器官运送的速度,并增加药物在靶器官的浓度。由于外泌体在形成过程中选择性的富集来源细胞的各种信号分子,且外泌体的组成可以反应来源细胞的生理及病理状态,因此,外泌体已被广泛用于许多疾病包括心血管疾病的诊断、治疗及预防。本研究旨在前期构建的携带有靶向缺氧/复氧损伤心肌细胞能力的归巢肽质粒(pLVX-IRES-ZsGreen1-mLAMP2b-CSTSMLKAC)的基础上进一步探讨经基因工程修饰后的外泌体是否可以将归巢肽展示在外泌体表面,及该外泌体是否具有靶向缺氧/复氧损伤心肌细胞的能力,从而为缺血性心脏病的靶向治疗提供一种全新的、理想的运送载体。方法:HEK293T细胞上通过Lipofectamine 2000转染携带具有靶向缺氧/复氧损伤心肌细胞能力的归巢肽质粒(p LVX-IRES-Zs Green1-m LAMP-2bCSTSMLKAC)和携带FLAG标签的对照质粒(p LVX-IRES-Zs Green1-mLAMP-2b-DY-KDDDDK),48小时后收取细胞培养基,采用差速超速离心法提取细胞培养基中的外泌体。通过电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析仪、Western blot方法对外泌体进行鉴定;免疫沉淀技术证明FLAG标签是否成功的展示在外泌体表面;利用胰酶联合∥型胶原酶两步法分离培养原代乳大鼠心肌细胞,加入250μM氯化钴共同培养12小时,然后正常培养2小时复制心肌细胞缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation,H/R)模型;采用qPCR检测缺氧诱导因子-1A的表达及乳酸脱氢酶试剂盒测定培养基中乳酸脱氢酶的活性对H/R-CMs模型进行鉴定;荧光染料(红色荧光)标记靶向外泌体并分别加入正常的乳大鼠心肌细胞及缺氧/复氧的心肌细胞,细胞免疫荧光技术检测外泌体的分布情况。结果:(1)电镜下差速超速离心法分离得到的外泌体大小在100nm左右,具有球型的膜性结构,Western blot显示该外泌体为CD9和CD63蛋白阳性,并且非外泌体标志蛋白GRP94和Calnexin阴性;纳米颗粒跟踪分析仪示显示外泌体直径集中在50-100nm;(2)免疫沉淀结果显示FLAG标签成功的展示在了外泌体表面。(3)氯化钴共同培养的心肌细胞相比正常心肌细胞缺氧诱导因子-1A的表达水平明显上调(p<0.01);H/R-CMs组细胞培养基中乳酸脱氢酶的活性比正常心肌细胞培养基中乳酸脱氢酶的活性明显升高(P<0.01);(4)细胞免疫荧光示H/R-CMs中分布了较多的红色荧光,而正常心肌细胞中未见红色荧光。结论:靶向缺氧/复氧损伤心肌细胞的归巢肽成功地展示在外泌体表面,经修饰后的靶向外泌体具有靶向缺氧/复氧心肌细胞的能力。目的:探讨人食道癌相关基因4(Ecrg4)在心肌缺血/再灌注损伤中的作用及其机制。方法:采用结扎小鼠左冠状动脉前降支及分离培养的乳大鼠心肌细胞经氯化钴处理分别建立体内及体外水平的心肌缺血/再灌注损伤模型,实时荧光定量PCR、Western blot及免疫组化检测Ecrg4在心肌缺血/再灌注损伤后表达水平的变化。荧光素酶活性检测ECRG4启动子对缺氧的反应。实时荧光定量PCR(q PCR)法检测心肌细胞过表达Ecrg4后在发生缺氧/复氧损伤后炎症相关基因(IL1,CD44,NF-KB)及凋亡相关基因(Bcl2及Bax)表达水平的变化,流式细胞术检测心肌细胞过表达Ecrg4后心肌细胞的凋亡情况。结果:1.q PCR、Western blot及免疫组化显示Ecrg4在心肌缺血/再灌注损伤发生后其表达水平快速下调;2.ECRG4基因启动子(EP400)-304到-300含有的经典缺氧反应元件(HRE),对氯化钴诱导的缺氧高度敏感。HRE突变后(EP400mut)明显减低该启动子对氯化钴诱导的缺氧反应,HIF-1A显著抑制了EP400的启动子活性,而EP400mut则丧失了对HIF-1A的反应性(p<0.01);3.心肌细胞过表达Ecrg4后炎症相关基因(IL1,CD44,NF-KB)表达明显下调及抗凋亡基因Bcl2表达上调,促凋亡基因Bax下调(p<0.5);4.流式细胞分析显示过表达Ecrg4后心肌细胞凋亡率明显下降。结论:1.Ecrg4在心脏对缺氧的反应性中起重要的作用;2.Ecrg4在心肌缺血/再灌注损伤后表达下调,过表达Ecrg4后,炎症因子及促凋亡相关基因的表达明显下调,抗凋亡相关基因明显上调,提示Ecrg4在心肌缺血/再灌注中起心脏保护作用,其机制为减轻心肌细胞炎症反应及减少心肌细胞的凋亡。