[目 的]高危型人乳头瘤病毒(High risk human papillomavirus,HR-HPV)感染是宫颈癌的病因,但是并非所有的感染者都会患宫颈癌。多数感染者,病毒会被自身的免疫系统清除,只有持续感染才会发展成宫颈癌。机体清除HPV的能力极易受到阴道微生态的影响。阴道菌群失调作为主要的协同因素,促使HR-HPV长期感染宫颈并最终导致癌变。本研究对从HR-HPV初次感染宫颈,到发展为宫颈癌过程中的不同阶段的阴道菌群进行检测,获得总的菌群信息。研究阴道菌群变化与HR-HPV感染和宫颈癌之间的关系,目的在于阐明阴道菌群在宫颈癌发生、发展过程中的变化特点,并寻找最可能的差异细菌进一步研究。为宫颈癌的防治寻找新的思路。[方法]收集云南省肿瘤医院(昆明医科大学第三附属医院)2017年12月-2018年12月符合入组标准的90例女性阴道分泌物拭子,单纯HR-HPV感染30例,HR-HPV感染并诊断为宫颈上皮内瘤变患者(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)30例,HR-HPV感染并诊断为宫颈鳞状细胞癌Ib1期患者30例。同时选取同期在妇科门诊体检的健康女性30例,HR-HPV均为阴性。提取阴道分泌物总DNA进行高通量测序,对测序结果进行生物信息学分析和统计学处理。从HR-HPV感染状态和宫颈病变程度两方面分析阴道菌群的结构差异和变化特点,并最终筛选出最可能的差异细菌进一步研究。[结 果]◆健康女性、HR-HPV(+)女性阴道菌群中乳酸杆菌占绝对优势(丰度>50%)。HR-HPV(+)女性乳酸杆菌在门、纲、目、科水平上较正常女性丰度有所下降,但是未出现统计学差异(P>0.05);两组样本的菌群分布在门、纲、目、科、属、种六个水平上均具有统计学差异(P<0.05);◆菌群多样性分析发现:健康女性、HR-HPV(+)女性的chao指数和ace指数相当,差异无统计学意义(P>0.05),说明两组样本中总的菌群数量一样多。HR-HPV(+)女性shannon指数明显高于健康女性(P<0.05),simpson指数明显低于健康女性(P<0.05)。说明HPV(+)女性阴道菌群结构组成具有明显多样性、复杂性和不均匀性;◆单纯HR-HPV(+)、宫颈癌前病变、宫颈癌患者阴道菌群均以乳酸杆菌占绝对优势(丰度>50%)。随着疾病的进展,乳酸杆菌丰度有所下降,但是未出现统计学差异(P>0.05);三组样本菌群构成在门、纲、目、科、属、种六个水平上明显不同,差异具有统计学意义(P<0.05);◆菌群多样性分析发现:单纯HR-HPV(+)、宫颈癌前病变、宫颈癌患者阴道菌群的chao指数、ace指数差别无统计学意义(P>0.05),表明三组样本阴道菌群的丰富度(即数量)相当。shannon指数、simpson指数差异有统计学意义(P<0.05),表明三组样本菌群多样性存在差异。组内比较发现:单纯HR-HPV感染组与宫颈癌前病变组无论是在丰富度上(chao指数、ace指数)还是在多样性上(shannon指数、simpson指数)均无统计学差异(P>0.05)。说明这两组菌群结构相似,可以归为非癌组。而宫颈癌组与HR-HPV感染组、宫颈癌前病变组比较,在菌群多样性上(shannon指数、simpson指数)具有明显的统计学差异(P<0.05),并且随着疾病的进展,差异越显著(P<0.05);◆差异分析发现:阴道加德纳菌是HR-HPV感染和宫颈癌患者阴道菌群中的主要差异细菌(P<0.05);[结论]乳酸杆菌是女性阴道的绝对优势菌群。阴道菌群结构的变化,特别是菌群多样性、复杂性的增加与HR-HPV感染以及宫颈癌变有关。阴道加德纳菌是HR-HPV感染、宫颈癌患者阴道菌群中的主要差异细菌,是HR-HPV长期感染宫颈并诱发癌变的主要协同因素。[目 的]第一部分研究发现,阴道加德纳菌是HR-HPV感染和宫颈癌患者阴道菌群中的主要差异细菌。研究表明,阴道加德纳菌具有较强的生物膜形成能力,在女性阴道中主要以生物膜形式存在。本部分研究拟于在体外建立阴道加德纳菌生物膜模型,对其成膜规律、形成特点和空间结构进行描述。探讨随女性月经周期,发生规律性变化的雌激素水平对阴道加德纳菌生物膜形成的影响。目的在于阐明阴道加德纳菌生物膜形成特点,为下一步成功提取成熟生物膜建立基础。同时初步探讨雌激素对阴道加德纳菌生物膜形成的影响,为临床治疗阴道加德纳菌感染寻找新的途径。[方法]首先,在体外以96孔板为载体建立阴道加德纳菌生物膜模型。结晶紫半定量法检测生物膜形成量,从而描述其生物膜形成规律。其次,模拟女性体内雌二醇浓度,用含有不同浓度雌二醇(100pmol/L、200pmol/L、400pmol/L、1000pmol/L)的培养基,体外培养阴道加德纳菌生物膜,结晶紫半定量法检测不同浓度雌二醇对阴道加德纳菌生物膜形成的影响。之后,在体外以金属钛片为载体建立阴道加德纳菌生物膜模型,在扫描电镜下观察其空间结构和特点以及不同浓度雌二醇对其空间结构和特点的影响。激光共聚焦显微镜测量不同浓度雌二醇对阴道加德纳菌生物膜形成厚度、活/死菌比例的影响。[结 果]◆阴道加德纳菌12h开始逐渐形成生物膜,24h进入快速生长期,96h生物膜生成量达高峰(P<0.05),之后不再增加(P>0.05);◆96h时,阴道加德纳菌生物膜呈现典型的三维立体结构,呈现“蘑菇云”状层叠,中间有大量通道和细胞外基质,至此成熟生物膜己形成;◆不同浓度的雌二醇对阴道加德纳菌生物膜形成具有抑制作用(P<0.05),随着雌二醇浓度的增加(100pmol/L、200pmol/L、400pmol/L、1000pmol/L)抑制作用逐渐增强(P<0.05),400pmol/L与1000pmol/L雌二醇浓度的抑制作用相当(P>0.05),400pmol/L是抑制阴道加德纳菌生物膜形成的最适浓度;◆激光共聚焦显微镜观察,在相同时间点随着雌二醇浓度的增加,阴道加德纳菌生物膜厚度逐渐变薄(P<0.05)。在相同浓度下,随着时间的延长阴道加德纳菌生物膜逐渐变厚(P<0.05);◆扫描电镜、激光共聚焦显微镜下观察,发现相同时间点时,100pmol/L组的生物膜比200pmol/L的生物膜成熟(P<0.05)、200pmol/L组的比400pmol/L组的成熟(P<0.05);[结 论]阴道加德纳菌可以在聚乙烯、金属钛表面形成致密的生物膜,但生物膜生长速度较慢,成膜时间较长。雌二醇可以抑制阴道加德纳菌生物膜的形成,抑制作用与作用时间和浓度相关。雌二醇主要通过抑制阴道加德纳菌形成厚度、延缓生物膜形成进程、影响生物膜内部结构而发挥作用的。适当浓度的雌二醇可以作为治疗阴道加德纳菌生物膜感染的可选药物。[目 的]第二部分实验已经成功建立阴道加德纳菌生物膜体外模型,证实了雌二醇对阴道加德纳菌生物膜的形成具有抑制作用。本部分研究拟于在成功建立阴道加德纳菌生物膜体外模型的基础上,提取成熟生物膜。将阴道加德纳菌生物膜与宫颈癌前细胞(H8细胞)共培养,研究阴道加德纳菌生物膜对宫颈癌前细胞的生物学功能和上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transformation,EMT)相关标志物的影响,目的在于探讨阴道加德纳菌生物膜促进宫颈癌变的初步分子机制。同时,研究不同浓度雌激素对宫颈癌前细胞上皮间质转化的影响,为进一步评价雌激素治疗阴道加德纳菌生物膜感染的安全性提供依据。[方 法]首先,在体外成功培养阴道加德纳菌生物膜,并提取成熟生物膜。用含有不同浓度阴道加德纳菌生物膜的培养基体外培养H8细胞,CCK8法检测H8细胞增殖能力,Transwell法检测H8细胞迁移能力。利用RT-PCR、Western-blot方法检测不同浓度阴道加德纳菌生物膜刺激下,H8细胞上皮标志物E-cadherin、间质标志物N-cadherin、Snail、Vimentin的表达情况。将不同浓度的雌二醇(Opmol/L、200pmol/L、400pmol/L、800pmol/L)与 H8 细胞共培养,利用 RT-PCR 法检测H8细胞上皮标志物E-cadherin、间质标物Vimentin的表达情况。[结 果]◆阴道加德纳菌生物膜抑制H8细胞增殖(P<0.05),对H8细胞迁移无影响(P>0.05);◆阴道加德纳菌生物膜诱导H8细胞在基因水平上低表达上皮标志物E-cadherin(P<0.05),高表达间质标志物 N-cadherin、Snail、Vimentin(P<0.05);◆阴道加德纳菌生物膜诱导H8细胞在蛋白水平上低表达上皮标志物蛋白E-cadherin,高表达间质标志物蛋白 N-cadherin、Snail、Vimentin;◆不同浓度的雌二醇对H8细胞EMT相关标志物的表达无影响(P>0.05);[结 论]阴道加德纳菌生物膜对宫颈癌前细胞具有一定的细胞毒作用。阴道加德纳菌生物膜通过诱导宫颈癌前细胞发生上皮间质转化而发挥促癌作用。雌二醇不能诱导宫颈癌前细胞发生上皮间质转化,用于治疗阴道加德纳菌生物膜感染具有一定的安全性。[目 的]第三部分研究发现,阴道加德纳菌生物膜是通过诱导宫颈癌前细胞发生EMT而发挥促癌作用。EMT作为诱发细胞癌变的关键步骤已被学术界认可,但是其在阴道加德纳菌生物膜诱导宫颈癌变中的作用机制和信号调控尚不明确。本部分实验在之前建立的“阴道加德纳菌生物膜诱导H8细胞EMT”模型的基础上,进一步研究阴道加德纳菌生物膜诱发EMT的详细信号转导过程,旨在为阴道加德纳菌生物膜作为临床预防和治疗宫颈癌的新靶点提供科学依据。[方法]首先利用免疫荧光法检测阴道加德纳菌生物膜作用后,H8细胞的TLR4、P-Smad2/3蛋白的表达情况,初步探讨其在阴道加德纳菌生物膜诱导H8细胞发生EMT中的变化趋势。利用RT-PCR、Western-blot方法研究TGF-β1/Smad信号通路在阴道加德纳菌生物膜诱导的H8细胞EMT过程中的作用,进一步通过抑制TLR4蛋白的表达,研究TLRU对H8细胞EMT及TGF-β1/Smad信号通路的调控作用。[结 果]◆免疫荧光显示,阴道加德纳菌生物膜上调H8细胞TLR4、P-Smad2/3蛋白的表达;◆在“阴道加德纳菌生物膜诱导的H8细胞EMT”模型中加入0.1ng/ml TGF-βi(EMT阴性对照浓度),可以显著增强H8细胞的EMT(P<0.01)。提示阴道加德纳菌生物膜诱导H8细胞发生EMT是通过TGF-β1/Smad信号通路发挥作用的;◆在“阴道加德纳菌生物膜+0.1ng/ml TGF-βi”的H8细胞EMT模型中加入TLR4抑制剂,可以逆转H8细胞的EMT(P<0.01),证实了阴道加德纳菌生物膜诱导H8细胞的EMT是受到TLR4调控的;◆在“阴道加德纳菌生物膜+0.1ng/ml TGF-β1”的H8细胞EMT模型中加入TLR4抑制剂后,p-Smad2/3的表达显著下调,证实了 TGF-β1/Smad是其下游信号通路,受到TLR4调控;[结 论]阴道加德纳菌生物膜是通过TLR4-TGF-β1/Smad信号通路诱导H8细胞发生EMT,是阴道加德纳菌生物膜协同HR-HPV感染人宫颈上皮细胞并促发癌变的主要机制,可以作为预防和治疗宫颈癌的潜在靶点。