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研究背景成骨细胞-破骨细胞正常的功能偶联是骨折愈合的重要因素,骨折局部感染可导致骨折不愈合,局部感染会引起骨折断端成骨细胞及破骨细胞功能异常,进而干扰正常的成骨细胞-破骨细胞偶联,使断端出现游离死骨,死骨形成后导致感染难以控制形成恶性循环,最终导致骨折不愈合。因此临床又把感染导致的骨折不愈合称之为难治性骨折不愈合。骨折感染通常为混合感染,革兰氏阴性菌参与其中,脂多糖(LPS)是构成革兰氏阴性菌细胞壁主要的成分之一。但是脂多糖是否能干扰成骨细胞的正常功能导致偶联失调,及其相应的具体机制尚不明确。JAK-STAT信号通路作为一个重要的细胞信号通路在成骨细胞的发生、成熟、分化和凋亡中发挥着重要的作用。根据文献报道及本实验的研究结果,我们证实细菌脂多糖可激活JAK2/STAT5信号通路,继而干扰成骨细胞正常的分化功能;阻断JAK2/STAT5信号通路可逆转细胞脂多糖对于成骨细胞分化功能的影响。研究目的1.体外实验。研究不同浓度脂多糖对成骨细胞活性、成骨功能指标的影响,为寻找脂多糖作用成骨细胞的靶点提供分子生物学研究基础。2.培养MC3T3-E1细胞,以不同浓度LPS处理,结合JAK2-siRNA,检测成骨细胞活性、成骨功能指标的影响,为寻找治疗细菌感染导致的骨不连的药物靶点提供分子生物学研究基础。3.体内实验。建立动物感染骨折愈合模型,分为对照组、炎症组、治疗组,观察骨折愈合过程情况、检测骨折处骨密度、骨小梁分离度等指标的变化,检测骨折处软骨化骨程度、成骨细胞数量的变化,说明JAK2-STAT5信号通路在脂多糖是否影响成骨细胞生长分化中发挥作用,为治疗细菌感染导致的骨折不愈合垫定实验基础。方法第一部分:1.体外培养MC3T3-E1细胞系。2.成骨细胞骨矿化结节染色,碱性磷酸酶活性检测。3.人类重组骨形态发生蛋白2(BMP-2),RunX-2蛋白及I型前胶原氨基端前肽的含量检测。4.MTT法细胞活性检测。5.免疫印迹法检测脂多糖干扰成骨细胞中TLR-2、TLR-4、STAT5b蛋白的表达。第二部分:1.细胞系培养。2.siRNA的转染。3.免疫印迹法检测转染后JAK2表达水平。4.JAK2-siRNA转染成骨细胞骨矿化结节染色的检测。5.RT-PCR 法检测 TLR2,TLR4 的 mRNA 水平。6.酶联免疫吸附试验检测ALP,RUNX,BMP-2和PINP蛋白水平的变化。第三部分:1.动物骨折模型及内固定手术。2.X线检查骨折愈合情况,Micro-CT检测骨折部位骨密度(BMD)及骨小梁分离度(Tb.Sp)。3.番红固绿染色观察检测软骨细胞骨化成骨程度。4.HE染色、OCN免疫组化染色观察检测成骨细胞的数量。统计分析采用软件IBM SPSS Statistics 21进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示。对于基本符合正态分布或者偏正态分布的数据,2组或2组以上组间均数比较分别采用独立样本t检验和单因素方差分析。对于不符合正态分布的数据,2组或2组以上组间均数比较分别采用两独立样本非参数检验和多个独立样本非参数检验,检验方法分别为Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis H检验。P<0.05表示有统计学差异。结论1.LPS诱导成骨细胞矿化点呈浓度依赖性下降。2.LPS干扰成骨细胞,成骨细胞细胞活性降低,活性碱性磷酸酶水平降低。成骨分化相关蛋白RUNX2,BMP-2和PINP表达量逐渐递减,且与LPS呈浓度依赖性。3.不同浓度LPS干扰成骨细胞后TLR2,TLR4的mRNA与蛋白表达升高,p-STAT5b和JAK2的蛋白表达上升,并且均呈剂量依存性。4.siRNA-JAK2转染成骨细胞,JAK2的mRNA和蛋白表达水平下降。5.LPS干扰siRNA-JAK2转染成骨细胞骨后,转染组矿化点高于未转染组。RUNX2,BMP-2和PINP蛋白表达上升。6.术后2周小鼠胫骨骨折骨折愈合,对照组、治疗组中软骨细胞骨化程度高于炎症组,炎症组愈合过程较对照组与治疗组滞后。7.术后2周骨折区域骨密度对照组、治疗组均高于炎症组。骨小梁分离度对照组、治疗组均低于炎症组。8.术后2周、4周对照组、治疗组中成骨细胞个数较炎症组多,成骨活跃。