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研究目的脓毒症是由严重感染引起的系统性炎症反应综合征,是重症监护病房较常见的疾病和死亡原因之一,而脓毒症免疫抑制是脓毒症患者主要的致死原因。在脓毒症免疫抑制期,免疫细胞常常有内毒素耐受的表现。中性粒细胞是人体血液循环中数量最多的固有免疫细胞,作为机体的第一道防线,中性粒细胞在感染初期即可迅速穿越血管内皮细胞进入感染部位,通过脱颗粒、呼吸爆发以及形成中性粒细胞胞外诱捕网络等多种方式有效清除病原体。然而大量研究证明,严重脓毒症时由于免疫系统功能紊乱,中性粒细胞对感染部位释放的趋化因子反应性显著性降低,跨内皮迁移能力下降,无法发挥其清除病原菌的能力;同时,由于中性粒细胞在脏器微循环中的过度聚集、阻塞,会进一步导致脏器发生微循环障碍,进而促进多器官功能衰竭的发生。在脓毒症时如何增强和改善中性粒细胞迁移功能,并由此改善微循环障碍导致的脏器损伤和脓毒症预后成为这一领域研究的新热点。通过对脓毒症免疫抑制期患者中性粒细胞基因芯片结果的再分析,我们发现已知具有调节细胞迁移功能的蛋白—迁移侵袭抑制蛋白(migration and invasion protein,MIIP),在脓毒症免疫抑制期患者的中性粒细胞中基因表达明显上调。MIIP是一种新发现的抑制细胞迁移和侵袭的蛋白,可以通过多种途径抑制细胞的迁移能力。虽然目前对MIIP的研究主要集中在肿瘤侵袭和转移机制等领域,但有多项研究结果提示MIIP可能参与炎症反应的调节。组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)对于炎症反应中巨噬细胞和T细胞的功能调节具有重要意义,而MIIP可以与HDAC6结合,抑制其去乙酰化酶的能力。此外,NF-κB的活化及相关细胞因子的基因表达也会受到MIIP的调控。因此,我们推测MIIP可能导致脓毒症中性粒细胞迁移障碍。本研究目的旨在探讨细胞水平上内毒素耐受对中性粒细胞跨内皮迁移能力的影响及其潜在机制,通过对潜在机制的初步探讨希望能从改善中性粒细胞跨内皮迁移功能的角度为脓毒症免疫抑制期患者提供临床治疗新思路和新靶点。研究方法1、鉴于中性粒细胞本身易凋亡的特性,采用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)诱导HL-60分化而来的类中性粒细胞来替代正常的中性粒细胞。1.3%DMSO诱导HL-60 5d,使其分化为类中性粒细胞;获得的细胞进行台盼蓝染色,分析细胞活性,确保细胞活度大于95%。2、将类中性粒细胞分为Control组(PBS+PBS)、LPS组(PBS+LPS)和ET组(LPS*+LPS)。处理结束后,收集上清和细胞。3、将类中性粒细胞分为Control siRNA Control组、Control siRNA LPS组、Control siRNA ET组、MIIP siRNA Control组、MIIP siRNA LPS组和MIIP siRNA ET组。处理结束后,收集上清和细胞。4、将类中性粒细胞分为Control siRNA ET组、Control siRNA ET+Tubastatin A组、MIIP siRNA ET组和MIIP siRNA ET+Tubastatin A组。处理结束后,收集上清和细胞。5、在2、3、4条件下,使用Transwell检测各组类中性粒细胞跨内皮迁移能力的变化。6、在2的条件下运用qRT-PCR检测下各组细胞中MIIP mRNA的表达。7、在2、3的条件下运用WB检测各组细胞MIIP蛋白的表达;在3的条件下运用WB检测各组细胞HDAC6蛋白的表达;在3、4条件下运用WB检测各组细胞微管蛋白α-tubulin及其乙酰化和p65及其磷酸化的表达。8、在2的条件下,运用ELISA检测各组细胞上清中TNF-α的表达;在3、4条件下,运用ELISA检测各组细胞上清中IL-8及MCP-1的表达情况。9、选用GraphPad Prism 7.0软件处理数据,并进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(x±s)的形式表示,两组间差异比较采用t检验,P<0.05视为差异具有统计学意义。实验结果1.ET组类中性粒细胞与LPS组、Control组相比,其迁移数量明显降低,并且随着诱导内毒素耐受剂量的增加,其迁移能力逐渐减弱。MIIP的mRNA及蛋白含量与细胞迁移能力的变化趋势具有一致性。基因芯片结果分析中也发现,脓毒症免疫抑制期患者中性粒细胞中MIIP基因表达增加。2.与Control siRNA ET组相比,抑制MIIP表达可以一定程度改善内毒素耐受组细胞跨内皮迁移障碍,不影响Control组和LPS组的中性粒细胞跨内皮迁移能力;Tubastatin A可以逆转因抑制MIIP表达而引起的内毒素耐受类中性粒细胞跨内皮迁移的能力。3、同Control siRNA ET组相比,抑制MIIP表达可以部分逆转内毒素耐受类中性粒细胞HDAC6蛋白表达下调。4、同Control siRNA ET组相比,抑制MIIP表达可以逆转内毒素耐受类中性粒细胞微管蛋白α-tubulin乙酰化的上调;Tubastatin A可以逆转因抑制MIIP表达而引起的内毒素耐受中性粒细胞微管蛋白α-tubulin乙酰化的上调。5、同Control siRNA ET组相比,抑制MIIP表达可以逆转内毒素耐受类中性粒细胞p65磷酸化水平及细胞因子IL-8和MCP-1的表达下调;Tubastatin A可以逆转因干扰MIIP表达而引起的内毒素耐受中性粒细胞p65磷酸化水平及细胞因子IL-8和MCP-1的表达上调。6、同Control siRNA组相比,抑制MIIP表达不影响p65及其磷酸化和细胞因子IL-8、MCP-1的表达,但可以上调Control组和LPS组细胞微管蛋白α-tubulin乙酰化水平。7、同ET组相比,Tubastatin A可以进一步抑制内毒素耐受类中性粒细胞跨内皮迁移,上调微管蛋白α-tubulin乙酰化水平,下调p65磷酸化水平及细胞因子IL-8和MCP-1的表达。结论内毒素耐受可引起中性粒细胞跨内皮细胞迁移功能的下降,其机制可能与内毒素耐受上调MIIP mRNA及蛋白表达,抑制HDAC6蛋白的量及其去乙酰化酶活性相关。在内毒素耐受中,MIIP可能通过抑制HDAC6去乙酰化酶活性从而上调微管蛋白α-tubulin的乙酰化,还可能通过抑制HDAC6去乙酰化酶活性从而抑制NF-κB的活化、细胞因子IL-8和MCP-1的产生来抑制中性粒细胞迁移。