结核菌／艾滋病病毒双重感染(Mtb/HIV双重感染)是结核病和艾滋病防治工作面临的严峻挑战之一,据WHO报道：2010年全球880万新增结核病患者中,有110万(1/8)合并HIV感染,其中约1/3患者病情迅速恶化,短期内发生死亡。目前针对Mtb/HIV双重感染者的治疗主要是抗结核和抗病毒药物治疗,面临服用多种药物、毒副作用大、疗程长、易产生耐药性等问题,因此亟须开发对双重感染者行之有效的治疗方法!Mtb和HIV属于胞内感染病原体,体液免疫难以对其发挥作用,抗Mtb和HIV的免疫机制主要是细胞免疫。Mtb/HIV双重感染者体内存在严重的细胞免疫功能缺陷,主要表现在：效应CD4+Th1(T helper1)细胞数量极度减少,功能明显下降,IFN-y (interferon-gamma)、TNF-a (tumor necrosis factor-a)分泌量减少；效应CD8+CTL (cytotoxic T lymphocyte cells)杀伤活性降低,IFN-γ、TNF-α、穿孔素和颗粒酶的分泌明显减少,对致病菌的杀伤活性减弱,不能有效控制疾病。有研究表明,通过过继输注效应T细胞给免疫低下或免疫缺陷的患者,可将保护性免疫传递给受者,增强受者体内效应T细胞对靶抗原的特异性识别及杀伤能力并改善患者的免疫状态。有文献表明,对结核患者过继输注效应T细胞可清除患者体内的结核杆菌。另外,将患者自体体外扩增的CD8+CTL过继输入治疗HIV病人已取得了明显的疗效。但是过继输注效应T细胞治疗Mtb/HIV双重感染者的研究未见报道,原因可能是双重感染者体内效应T细胞数量少,体外分离及大量扩增难度极大,限制了其临床应用。T细胞受体(T cell receptor, TCR)是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的效应分子。近二十年来,有学者分离抗原特异TCR基因并将其转导至初始T细胞中,使该T细胞表达外源TCR并获得特异性识别抗原的能力,通过这一方法,可短期内获得大量抗原特异的效应T细胞,为过继细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy, ACT)提供新途径。抗原特异TCR基因修饰T细胞过继输注治疗白血病、转移性黑色素瘤、巨细胞病毒感染、EB病毒感染等疾病已取得了鼓舞人心的治疗效果,被证明是一种有前景的治疗策略。我们之前的研究发现结核38kDa抗原特异TCR基因修饰的CD4+、CD8+T细胞均能特异性识别结核抗原并发挥免疫活性。此外未见有关结核TCR基因修饰的报道。针对HIV抗原特异的TCR基因修饰T细胞的研究也有报道,证明修饰的CD8+T细胞具有良好的抗HIV活性。2011年Blood报道了Hofmann C. et al.等的研究,通过RNA电穿孔他们将两种HIV-1肽特异的TCRs同时转导至T细胞中,并筛选出可同时表达两种外源性TCRs的T细胞,体外实验表明,表达双外源性TCR基因的T细胞具有双特异性,可同时识别两种HIV-1肽,并能分泌效应细胞因子和介导杀伤活性。然而,分离针对TB抗原和HIV抗原特异的TCR基因,并将两种TCR基因同时转染T细胞,检测其对两种抗原的特异性识别能力和免疫活性的研究尚未见报道。TCR基因转导过程中,内源性与外源性TCR a、p链之间的配对形成的杂合TCR将会稀释转导TCR在T细胞表面的表达,导致细胞表面转导TCR的表达量下降、细胞活性降低。为此,我们采用三种策略来解决错配：1)将Mtb Ag85B199-207特异的TCRα、p链恒定区(constant region, C)进行最小突变改造；2)将HIV-1Env120-128特异的TCR α、p链部分C区替换为完整的CD3ζ分子；3)采用3个2A肽段(P2A, T2A,F2A)连接上述四条基因片段以促使它们均衡表达。据文献报道,将人TCRα、β链C区9个关键位点的氨基酸替换为鼠源性氨基酸(最小突变)可促使转导TCRα、β链间正确配对,使之与CD3分子结合更加紧密,并提高转导TCR在修饰细胞表面的表达水平和介导增强的抗原识别功能。另外,将TCR α、p链部分胞外区、跨膜区与胞浆区替换为完整的CD3ζ分子可极大程度地保证转导TCRαβ:CD3ζ的正确配对并显著提高转导TCR在修饰T细胞表面的表达水平与功能。同时,为了实现这四条基因片段的均衡表达,我们采用2A肽段对其进行连接。2A序列的共同特点是在其C端含有保守序列GDVE(S/E)NPGP,可在其序列末端的甘氨酸和脯氨酸之间发生自剪切作用,形成均衡表达的两个肽段。有文献报道,2A肽介导的剪切效率几乎达到100%,可使基因产物近乎实现等量表达。我们分别分离出Mtb Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV-1Env120-128(KLTPLCVTL)特异的TCR基因,通过逆转录病毒载体将两种TCRs基因同时转导至初始CD8+T细胞,使其同时表达这两种抗原肽特异的TCRs。研究表明,双TCR基因修饰的T细胞可特异性地识别和杀伤负载Ag85B199-207或EnV120-128的DC,并分泌效应细胞因子。本研究为Mtb/HIV双抗原特异性TCR基因修饰T细胞应用于Mtb/HIV双重感染者的过继细胞免疫治疗研究提供基础。方法(一)筛选Ag85B199-20,特异的TCR与Env120-128特异的TCR①采用淋巴细胞分离液分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC);②计数PBMC,调整PBMC数目为1×106/孔,每孔细胞分别加入含Mtb Ag85B199-207肽HIV-1Env120-128肽50ng/ml的10%FBS-1640培养基2ml;③37℃、5%CO2条件下培养2h后,加入IL-225U/ml,第三天补加IL-2至50U/ml,第五天加入IL-2100U/ml,之后以此浓度继续培养11天；④磁珠分选CD8+T细胞,提取mRNA,并逆转录为cDNA;⑤互补决定区3(complementarity determining region3, CDR3)谱型分析检测刺激前后CDR3谱型,找出刺激后呈单克隆增生的Ag85B199-207特异的与EnV120-128特异的TCRα、β基因家族。(二)构建重组逆转录病毒载体与病毒滴度测定①根据GeneBank道的人TCRα、β基因家族上游可变区(variable region, V)和下游C区基因序列,设计TCRα、β链全长基因上、下游引物,扩增出Ag85B199-207特异的P16和Env120-128特异的α11、p18基因；②参照文献将Ag85B199-207特异的TCR a、p链C区的9个氨基酸替换为相应位点的鼠源性氨基酸。设计C区突变位点处上、下游引物,采用重组PCR方法将TCRα、β链C区的9个关键氨基酸进行置换；③根据文献报道设计TCR α、p链C区下游与CD3ζ分子融合位点处的重组引物,将Env120-128特异的TCRα11、p18基因片段与CD3ζ分子进行融合；④利用重组PCR技术,将已进行氨基酸置换的Ag85B199-207特异的TCRα13、β16基因片段通过自剪切多肽P2A进行连接,以获得最小突变TCR；⑤通过F2A上的AgeI酶切位点将EnV120-128特异的a11-CD3ζ、β18-CD3ζ融合基因进行拼接；⑥通过T2A上的AatlI酶切位点将上述四条基因片段进行连接；④⑤⑥步所得到的三种基因片段测序鉴定后插入逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP;⑦采用脂质体转染法,将三种重组逆转录病毒表达质粒pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVa13mCa-IRES-GFP、pMX-hβ18-CD3ζ-F2A-ha11-CD3ζ-IRES-GFP、pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCa-T2A-hp18-CD3ζ-F2A-ha11-CD3ζ-IRES-GFP与包膜蛋白质粒VSV-G共转染GP2-293；⑧收集48h-72h病毒上清,低温超速离心浓缩纯化病毒；⑨重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞术检测病毒滴度,计算公式：病毒滴度(IU/ml)=NIH3T3细胞数×GFP阳性率/病毒浓缩液量(m1)。(三)TCR基因修饰T细胞①采用Ficoll密度梯度离心法,分离HLA-A*0201型健康志愿者外周血PBMC;②磁珠分选CD8+T细胞；③IL-2和抗-CD3单抗活化分选出的T细胞；④按已摸索好的感染复数(multiplicity of infection, MOI),即MOI=13将上述三种重组逆转录病毒感染CD8+T细胞；⑤IL-2和抗-CD3单抗刺激感染后的T细胞；⑥流式细胞术检测病毒感染后GFP表达阳性率。(四)TCR基因修饰T细胞活性测定按已摸索好的效靶比(effector:target, E:T),将TCR基因修饰T细胞与负载抗原肽的DC/未负载抗原肽的DC共同培养。实验设置如下：①B/HIV Td+DC-Ag85B199-207组间比较：阴性对照组(Ag85B199-207+Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8+T细胞+DC)、未转染组(未转染CD8+T细胞+负载Ag85B199-20的DC)、空载体转染组(空载体转染CD8+T细胞+负载Ag85B199-207的DC)、无关肽组(Ag85B199-207+Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8+T细胞+负载PP65495-503的DC)、TB/HIVTd+DC-Ag85B99-207组(Ag85B199-207+Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8+T细胞+负载Ag85B199-207的DC)；②B/HIV Td+DC-Env120-128组间比较包括：阴性对照组(Ag85B199-207+Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8+T细胞+DC)、未转染组(未转染CD8+T细胞+负载Env120-1.28的DC)、空载体转染组(空载体转染CD8+T细胞+负载Env120-128的DC)、相关肽组(Ag85B199-207+Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8+T细胞+负载PP65495-503的DC)、TB/HIV Td+DC-Env120-128组(Ag85B199-207+Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8+T细胞+负载Env120-128的DC);③TB Td+DC-Ag85B199-207组间比较包括：阴性对照组(Ag85B199-207特异TCR基因修饰的CD8+T细胞+DC)、未转染组(未转染CD8+T细胞+负载Ag85B199-207的DC)、空载体转染组(空载体转染CD8+T细胞+负载Ag85B199-207的DC)、无关肽组(Ag85B199-207特异TCR基因修饰的CD8+T细胞+负载PP65495-503的DC)、TB Td+TB-DC组(Ag85B199-207特异TCR基因修饰的CD8+T细胞+负载Ag85B199-207的DC)；④HIV Td+DC-Env120-128组间比较包括：阴性对照组Env120-128特异TCR基因修饰的CD8+T细胞+DC)、未转染组(未转染CD8+T细胞+负载Env120q28的DC)、空载体转染组(空载体转染CD8+T细胞+负载Env120-128的DC)、无关肽组(Env120-128特异TCR基因修饰的CD8+T细胞+负载PP65495-503的DC)、HIV Td+Env120-128组(Env120-128特异TCR基因修饰的CD8+T细胞+负载Env120q28的DC)；⑤TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207与TB Td+DC-Ag85B199-207组间比较：TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207组(Ag85B199-207+Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8+T细胞+负载Ag85B199-207的DC)、TB Td+DC-Ag85B199-207(Ag85B199-207特异TCR基因修饰的CD8+T细胞+负载Ag85B199-207的DC)；⑥B/HIV Td+DC-Env120-128与HIV Td+DC-Env120-128组间比较：TB/HIV Td+DC-Env120-128组(Ag85B199-207+Env120-128特异TCRs基因共修饰的CD8+T细胞+负载Env120-128的DC)、HIV Td+DC-Env120-128组(Env120-128特异TCR基因修饰的CD8+T细胞+负载EnV120-128的DC)。以下实验对照设置均同此,实验重复3次。混合培养后,细胞培养上清中IFN-γ、TNF-a的分泌水平用酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进行检测；CD8+T细胞对负载抗原肽的DC的杀伤活性用时间分辨荧光免疫分析技术(time-resolved fluoroimmuno-assay, TRFIA)进行检测。(五)统计学分析采用SPSS17.0统计软件包进行统计分析。所有计量资料用x±s表示,不同处理组间CD8+T细胞的细胞因子分泌水平、杀伤活性方差齐性时采用单因素方差分析(One-WayANOVA),方差不齐时采用Welch法进行校正,多重比较方差齐性时用LSD法,方差不齐时用Dunnett’s T3法,双TCR基因修饰组与单TCR基因修饰组之间的比较采用两独立样本t检验。检验水准a=0.05,双侧检验。结果(一)分析刺激前后CDR3谱型,筛选出Ag85B199-207特异的TCR与Env120-128特异的TCR对CDR3谱型进行分析后发现,抗原肽刺激前T细胞各TCR Va (a chain variable gene)、Vβ(β chain variable gene)基因家族CDR3谱型呈8个或多于8个峰型的高斯分布(Gaussian distribution),表现为多家族性和多克隆性。而抗原肽刺激后,一个或两个TCR基因家族CDR3谱型发生改变,呈现偏态分布或者单峰分布,表明这些家族是因抗原肽的刺激而出现了寡克隆或单克隆增生。通过比较刺激前后的CDR3谱型,我们在CD8+T细胞中分别找到了针对Ag85B199-207特异的Val3、Vβ16和Env120-128特异的Va11、Vβ18基因家族。(二)构建重组载逆转录病毒载体并检测重组逆转录病毒的滴度成功扩增出Ag85B199-207特异的TCR α13、β16和Env120-128特异的α11、β18基因片段,分别将其克隆至pGEM-T载体后测序鉴定,结果与GeneBank报道的序列一致。采用重组PCR方法,扩增Ag85B199-207特异的TCRhVβ16mCβ-P2A-hVα13mCa融合基因,通过酶切连接的方法获得EnV120-128特异的TCR hβ18-CD3ζ-F2A-hα11-CD3ζ与hVβ16mCα-P2A-hVa13mCβ-T2A-hβ18-CD3ζ-F2A-ha11-CD3ζ融合基因,将上述三种基因片段分别插入pMX-IRES-GFP,构建重组逆转录病毒表达质粒pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVα13mCa-IRES-GFP、pMX-hβ18-CD3ζ-F2A-ha11-CD3ζ-IRES-GFP、与pMX-hVβ16mCβ-P2A-hVa13mCa-T2A-hβ18-CD3ζ-F2A-ha11-CD3ζ-IRES-GFP.将上述三种表达质粒与包膜蛋白质粒VSV-G共转染包装细胞GP2-293,48h-72h后收取病毒上清,低温超离浓缩纯化后感染NIH3T3细胞,流式细胞术检钡NIH3T3细胞GFP表达阳性率,经计算三种重组病毒滴度分别为1.59x107IU/ml、2.14x107IU/ml、8×106IU/ml。(三)TCR基因修饰CD8+T细胞的活性检测①TCR基因修饰CD8+T细胞IFN-γ分泌水平的检测按E：T=7,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载抗原肽的DC或未负载抗原肽的DC或混合培养18h,ELISA检测培养上清中IFN-γ的分泌水平。结果显示,双TCR基因修饰组(TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207组与TB/HIV Td+DC-Env120.128组)和仅转导一个特异TCR的T细胞组(TB Td+DC-Ag85B199-207组与HIVTd+DC-Env120-128组)与各对照组相比,IFN-γ分泌水平组间差异具有统计学意义(上述四组的F值和P值分别是F=11153.161,P<0.001; F=293.133,P<0.001; F=311.915, P<0.001;F=166.283,P<0.001)。将TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207组与TB Td+DC-Ag85B199-207组、TB/HIV Td+DC-Env120-128组与HIV Td+DC-Env120-128组进行比较,组间差异均具有统计学意义(t=8.313,P=0.001；t=14.603,P<0.001)。TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207组IFN-γ分泌量是1117.921pg/ml,是TB Td+DC-Ag85B199-207组分泌量的78.29%;TB/HIV Td+DC-Env120-128组IFN-y的分泌量是655.336pg/ml,是HIVTd+DC-Env120-128组分泌量的46.75%。②TCR基因修饰CD8+T细胞TNF-a分泌水平的检测按E：T=20,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载抗原肽的DC或未负载抗原肽的DC混合培养24h,ELISA检测培养上清中TNF-α的分泌水平。结果显示,双TCR基因修饰组(TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207组与TB/HIV Td+DC-Env120-128组)和仅转导一个特异TCR的T细胞组(TB Td+DC-Ag85B199-207组与HIV Td+DC-Env120-128组)与各对照组相比,TNF-a分泌水平组间差异具有统计学意义(上述四组的F值和P值分别是F=166.999,P<0.001：F=38.098,P=0.001；F=499.580,P<0.001；F=110.109,P<0.001)。将TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207组与TB Td+DC-Ag85B199-207组、TB/HIV Td+DC-Env120-128组与HIV Td+DC-Env120-128组进行比较,组间差异均具有统计学意义(t=9.219, P=0.001;t=5.427, P=0.006)。TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207组TNF-a的分泌量是738.840pg/ml,是TB Td+DC-Ag85B199-207组分泌量的71.03%; TB/HIV Td+DC-Env120-128组TNF-a的分泌量是660.337pg/ml,是HIV Td+DC-Env120-128组分泌量的65.43%。③TCR基因修饰CD8+T细胞的杀伤效应按E：T=30,将TCR基因修饰CD8+T细胞和负载抗原肽的DC或未负载抗原肽的DC混合培养,时间分辨免疫荧光法检测TCR基因修饰CD8+T细胞对DC或负载抗原肽的DC的杀伤活性。结果显示,双TCR基因修饰组(TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207组与TB/HIV Td+DC-Env120-128组)和仅转导一个特异TCR的T细胞组(TB Td+DC-Ag85B199-207组与HIV Td+DC-Env120-128组)与各对照组相比,对靶细胞的杀伤水平组间差异具有统计学意义(上述四组的F值和P值分别是F=372.417,P<0.001；F=114.856,P<0.001；F=812.729,P<0.001；F=78.281,P<0.001)。将TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207组与TB Td+DC-Ag85B199-207组、TB/HIVTd+DC-Env120-128组与HIV Td+DC-Env120-128组进行比较,组间差异均具有统计学意义,组间差异均具有统计学意义(t=9.527,P=0.001；t=7.579,P=0.002)。TB/HIV Td+DC-Ag85B199-207组杀伤率是35.16%,是TB Td+DC-Ag85B199-207组杀伤率的61.21%; TB/HIV Td+DC-Env12o-128组杀伤率是23.89%,是HIVTd+DC-Env120-128组杀伤率的51.4%。结论本实验中采用Mtb Ag85B199-207与HIV-1Env120-128刺激HLA-A*0201型健康志愿者外周血CD8+T细胞,分别获得针对这两种抗原肽特异的TCR。通过逆转录病毒载体介导将这两种TCR同时转导至初始CD8+T细胞,获得了可同时表达两种外源性TCR的T细胞。结果表明双TCR基因修饰的T细胞具有双特异性,它可针对Mtb和HIV-1两种病原体表位发生反应,并具有细胞因子分泌功能与杀伤活性。但将其与仅表达一种外源性TCR的T细胞进行比较时,其细胞因子分泌功能和杀伤活性弱于后者。尽管如此,双TCR基因修饰的T细胞其抗原肽特异的细胞因子分泌功能与杀伤活性仍显著高于未转染T细胞和空载体转染的T细胞。此外,与分次转导相比,同时转导多个基因具有转导效率高、低插入突变,转导基因均衡表达等优势。本研究为TCR基因修饰T细胞应用于Mtb/HIV共感染过继细胞免疫治疗奠定了基础,同时也为其他相关共感染性疾病的免疫治疗研究提供模式和平台。