【摘 要】
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目的 利用GFP-MS2系统在活细胞内对胰岛素样生长因子结合蛋白2 (insulin-like growth factor-binding protein 2,IGFBP2)mRNA 3′非翻译区(3′ untranslated region,3′UTR)
【机 构】
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天津医科大学基础医学研究中心,天津医科大学生物化学教研室,国家教育部免疫微环境与疫病重点实验室,天津市细胞与分子免疫学重点实验室
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目的 利用GFP-MS2系统在活细胞内对胰岛素样生长因子结合蛋白2 (insulin-like growth factor-binding protein 2,IGFBP2)mRNA 3′非翻译区(3′ untranslated region,3′UTR)进行绿色荧光标记,构建pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2重组质粒.方法 提取HeLa细胞总RNA,以针对IGFBP2-3′非翻译区的特异性片段为反转录引物,反转录出cDNA,并以其为模板,降落PCR法扩增出带有EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切位点的IGFBP2-3′UTR目的 基因,再利用双酶切法将目的 片段连接到pSG5载体(启动子为T7)上,构建重组质粒pT7-IGFBP2-3′UTR;同时,以BglⅡ和BamHⅠ双酶切法从pCR4-24×MS2SL-stable质粒上切下24×MS2结合位点片段并将其插入pT7-IGFBP2-3′UTR,构建重组质粒pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2;然后将构建的重组质粒pT7-IGFBP2-3′UTR-24×MS2、pMS2-GFP质粒与pERFP-Tudor-SN质粒共同转染入HeLa细胞内,以激光共聚焦荧光显微镜检测IGFBP2-3′UTR的荧光标记情况及应激共定位.结果 以酶切质粒法及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,激光共聚焦结果显示在胞浆中检测到IGFBP2-3′UTR的绿色荧光信号,在细胞受到氧化应激时IGFBP2-3′UTR信号呈颗粒状聚集,且与应激颗粒(stress granules,SGs)的标志蛋白Tudor-SN呈共定位关系.结论 针对IGFBP2-3′UTR的GFP-MS2荧光标记系统质粒构建成功;细胞应激时,IGFBP2-3′UTR被招募至SGs结构中.
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