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摘要[目的]研制高致病性PRRSV浓缩灭活疫苗。[方法]分别以病毒液、病毒浓缩液作为抗原，以甲醛、β丙内酯为灭活剂，制成A、B、 C、D 4种灭活疫苗，进行物理性状和无菌检验，安全检验合格后，与商品疫苗E进行免疫效果比较。[结果]4种疫苗均有良好的安全性。免疫后35 d，未浓缩抗原的A、C疫苗及商品疫苗E组抗体均未阳转，浓缩抗原的B、D疫苗组抗体阳转率分别达到80%和100%。[结论]浓缩病毒液制成的灭活疫苗比未浓缩病毒液制成的灭活疫苗及商品疫苗具有较好的免疫效果。
关键词高致病性PRRSV；浓缩；灭活疫苗；免疫效果
中图分类号S852.5文献标识码A文章编号0517-6611（2015）16-150-02
Development and Efficacy of Concentrated Inactivated Vaccines against Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
TIAN Yongxiang， YANG Keli*， DUAN Zhengying et al
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding， Wuhan， Hubei 430064）
Abstract [Objective] The research aimed to develop vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome. [Method] Using virus and concentrated virus as antigen， and using formaldehyde and βpropiolactone as inactivator， four inactivated vaccines against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome were prepared respectively. After the physical behavior， steriling test， and the safety test， the immunity effect of these four kinds of vaccines and one commercial vaccine were compared. [Result] These four kinds of vaccine all had good safety. After immunization 5 weeks， the specific antibody titers produced by concentrated inactivated vaccines B and D were 80% and 100% respectively， while no specific antibody titers produced by the unconcentrated inactivated vaccines A， C and the commercial vaccine E. [Conclusion] The immune effect of inactivated vaccines prepared with concentrated virus was better than those prepared with unconcentrated virus and the commercial vaccine in this study.
Key words Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome； Concentrated； Inactivated vaccines； Immune effect
豬繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的猪的具有高度传染性的病毒性疾病。任何年龄的猪均会被该病毒感染，其临床表现主要为：怀孕母猪感染后出现流产、早产和死胎等综合繁殖障碍性疾病，仔猪和育肥猪感染后则多出现呼吸道综合症状[1-3]。1987年，该病毒引起的疾病首次发现于美国，随后几年迅速在美洲、欧洲及亚洲的许多国家广泛流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失[4]。我国最早于1995年底发现此病，随后的2年内先后有研究人员分离到此病毒[5-6]，目前PRRSV仍然在我国很多省（市）的猪群内流行，是严重影响规模化养猪场健康可持续发展的主要疫病之一[7]。2006年，我国南方一些省份猪场暴发的高致病性猪蓝耳病传播迅速，在短短的半年内几乎传遍了大半个中国，特别是在养猪业比较发达的省份造成了巨大的经济损失[8-11]。
对猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的预防，目前大多采用免疫注射的方法，临床上常用的疫苗主要有2种：弱毒苗和灭活苗。弱毒苗注入猪体内的效果与感染野毒基本相同，只是病毒无致病性，能够诱导较强的有效免疫力，但弱毒苗接种体内后疫苗毒会在体内增殖，因此接种弱毒苗的猪有可能将疫苗病毒排出传递给尚未接种疫苗的猪，或者可能出现弱毒返强而引发疾病。灭活苗的安全性大大高于弱毒苗，并且不存在散毒的危险，但灭活苗诱导有效免疫力的能力较差。此外，PRRSV有抗体依赖增强作用的特点，低水平的抗体可能是诱发该病的原因之一。因此，研究能产生有效水平抗体的高效灭活疫苗具有现实意义。为了获得能够产生有效保护力的猪高致病性PRRSV疫苗，笔者在对高致病性PRRSV进行流行病学调查和病原分离与鉴定的基础上，进行了PRRSV浓缩灭活疫苗的研制，并研究了其疫苗免疫效果。 1材料与方法
1.1材料
1.1.1
疫苗用毒株。PRRSV EZ株，由动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室分离、鉴定与保存。
1.1.2
灭活疫苗。试制苗是采用EZ株Marc145细胞培养浓缩物，经灭活后加入油佐剂乳化而成。对照苗为购买的商品灭活苗。
1.1.3
试验动物。30～45日龄PRRS抗体阴性仔猪100头，购自湖北省农业科学院畜牧兽医研究所试验猪场。
1.1.4
试剂。PRRS抗体检测试剂盒，为IDEXX公司产品，购自北京爱德士元亨生物科技有限公司。
1.2方法
1.2.1
疫苗制备。将制苗毒株接种已长成单层的Marc145细胞，按照5%的剂量接种病毒液，37 ℃条件下吸附1 h后，加入维持液，置于37 ℃条件下继续培养。当细胞病变达70%以上时收获，置于-20 ℃条件下冻融2次，取样测定毒价。将已冻融2次的病毒收集液以40 000 r/min离心3 h，用TEN洗涤沉淀（体积为收集液的1/10，即浓缩10倍）。将病毒液和浓缩病毒液按以下分组进行灭活：A、B组分别将病毒液、病毒浓缩液按终浓度为0.1%的比例加入甲醛溶液，混匀，置于37 ℃条件下灭活18 h取出，置于2～8 ℃条件下保存。C、D组分别将病毒液、病毒浓缩液按终浓度为0.1%的比例加入β丙内酯，混匀，置于37 ℃条件下灭活2 h取出，置于2～8 ℃下保存。
分别取上述检验合格的灭活病毒悬液96份，加入4份灭菌吐温-80，搅拌均匀制成水相。取10#白油94份，加入6份司本-80，硬脂酸铝2份，加热搅拌溶化后116 ℃下灭菌30 min，制成油相。水相与油相按1∶1.5的比例分别制成4种油佐剂灭活苗，即A苗（甲醛灭活未浓缩病毒苗）、B苗（甲醛灭活浓缩病毒苗）、C苗（β丙内酯灭活未浓缩病毒苗）、D苗（β丙内酯灭活浓缩病毒苗）。
1.2.2
4种疫苗的物理性状检验。按照《中华人民共和国兽药典》3部2010年版中的方法，分别对4种灭活疫苗的进行剂型、稳定性等物理性状检验。
1.2.3
4种疫苗的无菌检验。按照《中华人民共和国兽药典》3部2010年版中的方法，分别对4种灭活疫苗进行细菌、霉菌、支原体的检测。
1.2.4
4种疫苗的安全性检验。4种灭活疫苗分别接种18～20 g小鼠10只，皮下注射0.2 ml/只，观察14 d，小鼠全部健活为合格。
1.2.5
4种疫苗的免疫效果试验。
将PRRS抗体检测为阴性的30～45日龄仔猪100头随机分成5组，每组20头，分别肌肉注射A、B、C、D自制灭活疫苗和市售商品灭活疫苗（E苗）2 ml。分别于注射疫苗3、4、5周时静脉采血分离血清，检测PRRS抗体。
1.2.6
抗体检测方法。采用IDEXX公司PRRS抗体检测试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。试验结果有效的条件为：阳性对照PRRSV孔OD值-阴性对照PRRSV孔OD值≥0.15，阳性对照NHC孔OD值≤0.12，阴性对照NHC孔OD值≤0.25。PRRSV抗体的结果判定标准为：当S/P值≥0.4时，被检样品为阳性；当S/P值<0.4时，被检样品为阴性。
2结果与分析
2.14种疫苗的物理性状检验
按照现行兽药典的方法进行检验，4种灭活疫苗均为混悬液，混合均匀，无分层现象，达到油乳剂灭活疫苗标准。
2.24种疫苗的无菌检验结果
按照现行兽药典的方法进行检验，发现4种灭活疫苗均无细菌、霉菌及支原体生长，无菌检验合格。
2.34种疫苗的安全性检验结果
4种疫苗所接种的18～20 g小鼠10只，于接种后连续观察14 d，均全部健活，存活率为100%，安全检验合格。
2.4免疫后抗体检测结果
抗体检测结果表现，注射疫苗3～5周后，用甲醛或β丙内酯灭活未浓缩病毒液自制的A苗、C苗组及商品苗E苗组抗体均未阳转；用甲醛或β丙内酯灭活病毒浓缩液自制的B苗、D苗组抗体阳转率分别为20%、40%、80%和40%、60%、100%（表1）。
表1 免疫后仔猪PRRS抗体的检测结果
组别抗体阳性率∥%
免疫3周免疫4周免疫5周
A000
B204080
C000
D4060100
E000
3讨论
该试验结果表明，浓缩病毒液制成的灭活疫苗比未浓缩病毒液制成的灭活疫苗及商品疫苗具有较好的免疫效果，能够在免疫后相同时间内产生抗体，有利于临床上该病的免疫预防。该疫苗系用从湖北省分离的猪繁殖与呼吸综合征高致病性病毒制成的油乳剂灭活苗，针对性强、产毒稳定、免疫原性良好。因此，用该病毒作为抗原制备疫苗对控制高致病性PRRSV以及减轻目前该病对湖北省部分猪群造成的危害意义重大。
该研究中笔者观察到疫苗免疫后出现阳性抗体的时间较长，符合油佐剂灭活疫苗特点。未浓缩抗原疫苗及商品疫苗在免疫后35 d仍未出现能检测到的PRRS阳性抗体，而浓缩抗原疫苗在免疫后21 d部分猪出现能检测到的PRRS阳性抗体，28 d左右半数或接近半数抗体阳转，抗体阳转高峰出现在免疫后5周，初步表明PRRSV灭活疫苗的免疫效果与抗原浓度有直接的关系。
免疫后3～5周，用β丙内酯灭活的D苗比用甲醛灭活的B苗抗体阳转数高，说明PRRSV灭活苗用β丙内酯作病毒抗原灭活剂效果较好。
该研究中浓缩灭活苗免疫后抗体阳转高峰出现时间与Yoon等[12]报道基本一致，而与以前国内报道的用PRRS油乳剂灭活疫苗免疫后20 d左右达到抗体高峰有一定差异[13-14]。是否与抗原差异、检测方法及试剂盒有关，则有待进一步研究。
笔者制备的PRRSV浓缩灭活疫苗，没有弱毒苗残余毒力或毒力返強导致PRRS暴发流行的危险，并便于运输和保存，并且具有对母源抗体无干扰作用的优点，适于国内受高致病性PRRSV威胁的猪群使用。
参考文献
[1]
HILL H.Overview and history of mystery swine disease （swine infertility and respiratory syndrome）[C]//Proceedings of the mystery swine disease communication meeting.Denver，CO，1990：29-31.
[2] CAVANAGH D.Nidovirdae：a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae[J].Arch Virol，1997，142：629-633.
[3] MAYO M A.A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV[J].Arch Virol，2002，147：1655-1656.
[4] ALBINA E.Epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome （PRRS）：An overview[J].Vet Microbiol，1997，55（1/4）：309-316.
[5] 郭宝清，陈章水，刘文兴，等.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J].中国畜禽传染病，1996，18（2）：1-4.
关键词高致病性PRRSV；浓缩；灭活疫苗；免疫效果
中图分类号S852.5文献标识码A文章编号0517-6611（2015）16-150-02
Development and Efficacy of Concentrated Inactivated Vaccines against Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
TIAN Yongxiang， YANG Keli*， DUAN Zhengying et al
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding， Wuhan， Hubei 430064）
Abstract [Objective] The research aimed to develop vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome. [Method] Using virus and concentrated virus as antigen， and using formaldehyde and βpropiolactone as inactivator， four inactivated vaccines against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome were prepared respectively. After the physical behavior， steriling test， and the safety test， the immunity effect of these four kinds of vaccines and one commercial vaccine were compared. [Result] These four kinds of vaccine all had good safety. After immunization 5 weeks， the specific antibody titers produced by concentrated inactivated vaccines B and D were 80% and 100% respectively， while no specific antibody titers produced by the unconcentrated inactivated vaccines A， C and the commercial vaccine E. [Conclusion] The immune effect of inactivated vaccines prepared with concentrated virus was better than those prepared with unconcentrated virus and the commercial vaccine in this study.
Key words Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome； Concentrated； Inactivated vaccines； Immune effect
豬繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的猪的具有高度传染性的病毒性疾病。任何年龄的猪均会被该病毒感染，其临床表现主要为：怀孕母猪感染后出现流产、早产和死胎等综合繁殖障碍性疾病，仔猪和育肥猪感染后则多出现呼吸道综合症状[1-3]。1987年，该病毒引起的疾病首次发现于美国，随后几年迅速在美洲、欧洲及亚洲的许多国家广泛流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损失[4]。我国最早于1995年底发现此病，随后的2年内先后有研究人员分离到此病毒[5-6]，目前PRRSV仍然在我国很多省（市）的猪群内流行，是严重影响规模化养猪场健康可持续发展的主要疫病之一[7]。2006年，我国南方一些省份猪场暴发的高致病性猪蓝耳病传播迅速，在短短的半年内几乎传遍了大半个中国，特别是在养猪业比较发达的省份造成了巨大的经济损失[8-11]。
对猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的预防，目前大多采用免疫注射的方法，临床上常用的疫苗主要有2种：弱毒苗和灭活苗。弱毒苗注入猪体内的效果与感染野毒基本相同，只是病毒无致病性，能够诱导较强的有效免疫力，但弱毒苗接种体内后疫苗毒会在体内增殖，因此接种弱毒苗的猪有可能将疫苗病毒排出传递给尚未接种疫苗的猪，或者可能出现弱毒返强而引发疾病。灭活苗的安全性大大高于弱毒苗，并且不存在散毒的危险，但灭活苗诱导有效免疫力的能力较差。此外，PRRSV有抗体依赖增强作用的特点，低水平的抗体可能是诱发该病的原因之一。因此，研究能产生有效水平抗体的高效灭活疫苗具有现实意义。为了获得能够产生有效保护力的猪高致病性PRRSV疫苗，笔者在对高致病性PRRSV进行流行病学调查和病原分离与鉴定的基础上，进行了PRRSV浓缩灭活疫苗的研制，并研究了其疫苗免疫效果。 1材料与方法
1.1材料
1.1.1
疫苗用毒株。PRRSV EZ株，由动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室分离、鉴定与保存。
1.1.2
灭活疫苗。试制苗是采用EZ株Marc145细胞培养浓缩物，经灭活后加入油佐剂乳化而成。对照苗为购买的商品灭活苗。
1.1.3
试验动物。30～45日龄PRRS抗体阴性仔猪100头，购自湖北省农业科学院畜牧兽医研究所试验猪场。
1.1.4
试剂。PRRS抗体检测试剂盒，为IDEXX公司产品，购自北京爱德士元亨生物科技有限公司。
1.2方法
1.2.1
疫苗制备。将制苗毒株接种已长成单层的Marc145细胞，按照5%的剂量接种病毒液，37 ℃条件下吸附1 h后，加入维持液，置于37 ℃条件下继续培养。当细胞病变达70%以上时收获，置于-20 ℃条件下冻融2次，取样测定毒价。将已冻融2次的病毒收集液以40 000 r/min离心3 h，用TEN洗涤沉淀（体积为收集液的1/10，即浓缩10倍）。将病毒液和浓缩病毒液按以下分组进行灭活：A、B组分别将病毒液、病毒浓缩液按终浓度为0.1%的比例加入甲醛溶液，混匀，置于37 ℃条件下灭活18 h取出，置于2～8 ℃条件下保存。C、D组分别将病毒液、病毒浓缩液按终浓度为0.1%的比例加入β丙内酯，混匀，置于37 ℃条件下灭活2 h取出，置于2～8 ℃下保存。
分别取上述检验合格的灭活病毒悬液96份，加入4份灭菌吐温-80，搅拌均匀制成水相。取10#白油94份，加入6份司本-80，硬脂酸铝2份，加热搅拌溶化后116 ℃下灭菌30 min，制成油相。水相与油相按1∶1.5的比例分别制成4种油佐剂灭活苗，即A苗（甲醛灭活未浓缩病毒苗）、B苗（甲醛灭活浓缩病毒苗）、C苗（β丙内酯灭活未浓缩病毒苗）、D苗（β丙内酯灭活浓缩病毒苗）。
1.2.2
4种疫苗的物理性状检验。按照《中华人民共和国兽药典》3部2010年版中的方法，分别对4种灭活疫苗的进行剂型、稳定性等物理性状检验。
1.2.3
4种疫苗的无菌检验。按照《中华人民共和国兽药典》3部2010年版中的方法，分别对4种灭活疫苗进行细菌、霉菌、支原体的检测。
1.2.4
4种疫苗的安全性检验。4种灭活疫苗分别接种18～20 g小鼠10只，皮下注射0.2 ml/只，观察14 d，小鼠全部健活为合格。
1.2.5
4种疫苗的免疫效果试验。
将PRRS抗体检测为阴性的30～45日龄仔猪100头随机分成5组，每组20头，分别肌肉注射A、B、C、D自制灭活疫苗和市售商品灭活疫苗（E苗）2 ml。分别于注射疫苗3、4、5周时静脉采血分离血清，检测PRRS抗体。
1.2.6
抗体检测方法。采用IDEXX公司PRRS抗体检测试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作。试验结果有效的条件为：阳性对照PRRSV孔OD值-阴性对照PRRSV孔OD值≥0.15，阳性对照NHC孔OD值≤0.12，阴性对照NHC孔OD值≤0.25。PRRSV抗体的结果判定标准为：当S/P值≥0.4时，被检样品为阳性；当S/P值<0.4时，被检样品为阴性。
2结果与分析
2.14种疫苗的物理性状检验
按照现行兽药典的方法进行检验，4种灭活疫苗均为混悬液，混合均匀，无分层现象，达到油乳剂灭活疫苗标准。
2.24种疫苗的无菌检验结果
按照现行兽药典的方法进行检验，发现4种灭活疫苗均无细菌、霉菌及支原体生长，无菌检验合格。
2.34种疫苗的安全性检验结果
4种疫苗所接种的18～20 g小鼠10只，于接种后连续观察14 d，均全部健活，存活率为100%，安全检验合格。
2.4免疫后抗体检测结果
抗体检测结果表现，注射疫苗3～5周后，用甲醛或β丙内酯灭活未浓缩病毒液自制的A苗、C苗组及商品苗E苗组抗体均未阳转；用甲醛或β丙内酯灭活病毒浓缩液自制的B苗、D苗组抗体阳转率分别为20%、40%、80%和40%、60%、100%（表1）。
表1 免疫后仔猪PRRS抗体的检测结果
组别抗体阳性率∥%
免疫3周免疫4周免疫5周
A000
B204080
C000
D4060100
E000
3讨论
该试验结果表明，浓缩病毒液制成的灭活疫苗比未浓缩病毒液制成的灭活疫苗及商品疫苗具有较好的免疫效果，能够在免疫后相同时间内产生抗体，有利于临床上该病的免疫预防。该疫苗系用从湖北省分离的猪繁殖与呼吸综合征高致病性病毒制成的油乳剂灭活苗，针对性强、产毒稳定、免疫原性良好。因此，用该病毒作为抗原制备疫苗对控制高致病性PRRSV以及减轻目前该病对湖北省部分猪群造成的危害意义重大。
该研究中笔者观察到疫苗免疫后出现阳性抗体的时间较长，符合油佐剂灭活疫苗特点。未浓缩抗原疫苗及商品疫苗在免疫后35 d仍未出现能检测到的PRRS阳性抗体，而浓缩抗原疫苗在免疫后21 d部分猪出现能检测到的PRRS阳性抗体，28 d左右半数或接近半数抗体阳转，抗体阳转高峰出现在免疫后5周，初步表明PRRSV灭活疫苗的免疫效果与抗原浓度有直接的关系。
免疫后3～5周，用β丙内酯灭活的D苗比用甲醛灭活的B苗抗体阳转数高，说明PRRSV灭活苗用β丙内酯作病毒抗原灭活剂效果较好。
该研究中浓缩灭活苗免疫后抗体阳转高峰出现时间与Yoon等[12]报道基本一致，而与以前国内报道的用PRRS油乳剂灭活疫苗免疫后20 d左右达到抗体高峰有一定差异[13-14]。是否与抗原差异、检测方法及试剂盒有关，则有待进一步研究。
笔者制备的PRRSV浓缩灭活疫苗，没有弱毒苗残余毒力或毒力返強导致PRRS暴发流行的危险，并便于运输和保存，并且具有对母源抗体无干扰作用的优点，适于国内受高致病性PRRSV威胁的猪群使用。
参考文献
[1]
HILL H.Overview and history of mystery swine disease （swine infertility and respiratory syndrome）[C]//Proceedings of the mystery swine disease communication meeting.Denver，CO，1990：29-31.
[2] CAVANAGH D.Nidovirdae：a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae[J].Arch Virol，1997，142：629-633.
[3] MAYO M A.A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV[J].Arch Virol，2002，147：1655-1656.
[4] ALBINA E.Epidemiology of porcine reproductive and respiratory syndrome （PRRS）：An overview[J].Vet Microbiol，1997，55（1/4）：309-316.
[5] 郭宝清，陈章水，刘文兴，等.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J].中国畜禽传染病，1996，18（2）：1-4.