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[摘要] 目的 探讨浙江省急性腹泻患儿的常见病毒组成。 方法 采集5岁以下（≤5岁）急性腹泻患儿的811份粪便标本，采用ELISA方法检测A组轮状病毒（RV），应用多重PCR方法同时检测B/C组RV、诺如病毒（NoV）、札如病毒（SaV）、肠道腺病毒（AdV）、星状病毒（AstV），并利用RT-PCR对RV的阳性标本进行G、P分型。结果 811份粪便样本中，RV、NoV、SaV、AdV 及AstV总的阳性比例分别为25.52%、18.37%、4.44%、2.71%和1.23%；65份（8.01%）混合感染标本中以RV和NoV混合感染所占比例最大（56.92%）； 116份RV的G/P分型中，G3型（37.93%）、G1型（32.75%）和P[8]型（57.76%）是RV的优势型别，且G3/P[8]（27.59%）是混合感染最主要的组合。结论 浙江省五种常见腹泻病毒及其混合感染的流行状况，为临床治疗和疾病监测提供参考价值。
[关键词] 肠道病毒；急性腹泻；混合感染
[中图分类号] R725.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）12-0109-05
急性腹泻是世界范围内的一个不容忽略的公共卫生问题，在发展中国家，每年共有两百万人的死亡与急性腹泻有关，其中主要是婴幼儿[1]。随着抗生素的广泛应用，加之人们卫生习惯的改善，细菌性腹泻和寄生虫性腹泻感染已有所降低[2]，但是病毒性腹泻没有得到有效的控制。轮状病毒（Rotavirus，RV）、诺如病毒（Norovirus，NoV）、札如病毒（Sapovirus，SaV）、肠道腺病毒（Adenovirus，AdV）、星状病毒（Astrovirus，AstV）是引起婴幼儿病毒性腹泻最主要的五种病原[3]。本研究的目的是了解浙江省5岁以下门诊腹泻患儿中五种常见病毒以及混合感染的分布情况，为我国的病毒性腹泻的防控工作提供有价值的流行病学和临床治疗的数据支持。
1 材料与方法
1.1资料来源
本研究选取浙江省5家医院作为监测哨点（浙江大学医学院附属第一医院、浙江大学医学院附属儿童医院、浙江大学医学院附属第一医院北仑分院、湖州市中心医院和浙江中医药大学附属第一医院）。随机收集2010年1～12月期间5家哨点医院门诊病例中5岁以下（含5岁）急性腹泻患儿的粪便标本811份。标本采集对象均符合每日排便3次或以上，且大便性状有改变（呈水样便、稀便）。每个患者只采集一份粪便标本，标本采集时间覆盖全年各月，每周均有采集；在进行核酸提取之前，所有标本都储存在-80℃。
1.2核酸的提取
将粪便标本在标本处理液（PBS液）中按1：10比例稀释后，再以8 000转/min离心5 min，最后留取上清液于-20℃待测。取200～400 μL处理好的粪便标本上清液，使用台湾Geneaid 公司生产的商品化核酸提取试剂盒（货号：VR100）对标本上清液进行核酸提取，操作方法详见试剂盒说明书。
1.3检测方法
1.3.1 A组轮状病毒检测及其G、P基因分型 采用DAKO轮状病毒ELISA检测试剂盒检测粪便上清液中的A组轮状病毒，操作步骤详见试剂盒说明书。对A组轮状病毒阳性的标本进一步采用一个两步扩增的逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）进行G、P基因分型，方法同以前研究[4]。G基因分型在第一步扩增中使用Beg9 （forward）/End9 （reverse）作为一对引物扩增出一条1 062 bp的基因片段，该片段在第二步扩增体系中作为鉴定G1、G2、G3、G4、G8和 G9型别的模板；P基因分型中第一步扩增中则使用一个引物对-Con3/Con2扩增一条876 bp的基因片段，作为第二步扩增的模板，鉴定P[4]、P[6]、P[8]、P[9]和P[10]。
1.3.2 B/C组轮状病毒、诺如病毒（GI和GII）、札如病毒、肠道腺病毒、星状病毒多重PCR检测 将提取的病毒核酸应用随机引物（NO： C1181， Promega， USA）合成病毒cDNA，条件为50℃逆转录1 h，99℃灭活逆转录酶5 min后，然后迅速放入冰内冷却。然后以合成的cDNA为模板，进行B/C组轮状病毒、诺如病毒（GI和GII）、札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒的多重PCR检测。多重PCR在25μL反应体系中进行，包括10×Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mol/L dNTP 2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，5 U/μLTaq DNA聚合酶0.125 μL，7对病毒特异性引物（表1）（各33 μmol/L，0.2 μL）的混合物，模板核酸（除肠道腺病毒为DNA，其他均为cDNA）2.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反应条件为94℃预变性5 min，然后在94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min条件下进行35个循环，最后以72℃终延伸7 min，4℃下终止反应。最后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.4统计学方法
利用SPSS18.0和Excel软件进行统计学分析，不同组别的患者和不同病毒的感染率等变量之间的差异采用两独立样本t检验和χ2检验分析，检验统计采用95%的可信区间（P = 0.05），P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 检测结果
811份标本中， 353份（43.53%）检出一种或一种以上病毒，其中288份为单病毒感染，占35.51%（288/811），混合感染65份，占8.01%（65/811），总体来看，轮状病毒是引起儿童腹泻最主要的病毒，共207份标本检出，占25.52%（207/811），其次是诺如病毒占18.37%（147/811），札如病毒占4.44%（36/811），肠道腺病毒和星状病毒检出率阳性比例较低，分别占2.71%（22/811）和1.23%（10/811）。 单病毒感染中轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、肠道腺病毒与星状病毒的阳性比例分别是18.4% （149/811）、 12.6% （102/811）、6.5% （23/811）、2.8% （10/811）和0.5% （4/811）。轮状病毒是混合感染中最常见的病毒（89.23%，58/65），轮状病毒和诺如病毒是两两混合感染中最常见的组合，共37例，占4.6%，其次是轮状病毒和札如病毒混合感染，共10例（1.2%），其他两种病毒混合感染情况的阳性比例均小于0.5%。此外，我们还发现3份标本为轮状病毒、诺如病毒和肠道腺病毒3种病毒同时感染，1份为轮状病毒、札如病毒和肠道腺病毒混合感染。
图1 病毒检测结果分布。
（A） 353例病毒检测阳性结果分布； （B） 65例混合感染分布
（RV， rotavirus； NoV， norovirus； SaV， sapovirus； AdV， adenovirus； AstV， astrovirus）.
2.2 性别和年龄分布
811例≤5 岁腹泻患儿中，男547例，女264例，平均年龄（12.76±11.15）个月，年龄范围1～60月龄（表2）。轮状病毒感染平均月龄为（10.76±7.19）个月，比诺如病毒平均月龄（13.71±9.61）低（P = 0.009）。轮状病毒在7～12月龄组患儿中阳性比例最高，与其他年龄组相比，差异有统计学意义（χ2=12.203，P < 0.01），25～60月龄组阳性比例（5.26%）最低；诺如病毒感染发病高峰在13～24月龄组，较其他年龄组高（χ2=8.565，P = 0.003），但是在13～24月龄组无札如病毒检出；肠道腺病毒和星状病毒感染全部发生于24月龄组以下儿童；混合感染中2岁以上患儿的阳性比例较2岁以下儿童高（P < 0.01）。见表2。
2.3病毒的基因分型
206份轮状病毒阳性标本中，均为A组轮状病毒，未发现B和C组轮状病毒，A组轮状病毒标本中的116份做了进一步的G、P基因型鉴定，结果G3型44份（37.93%），G1型38份（32.75%），G4型6份（5.17%），G2型6份（5.17%），G9型5份（4.31%），检出G1和G3型混合感染1份（0.86%），未确定型别16份（13.79%）；P[8]基因型 67份（57.76%），P[4] 型17份（14.66%）、P[6]型5份（4.31%）、P[10] 型2份（1.72%）和P[9]型1份（0.86%），未确定P基因型24份（20.69%）。见表3。
G、P基因型组合以P[8]G3组合为主，占27.59%（32/116），其次是P[8]G1，占16.38%（19/116），P[4]G1占6.03%，P[8]G4占5.17%。
此外，147份诺如病毒阳性标本包括GII基因型116份（占78.91%），G I基因型29份（占19.73 %），GI和GII型混合感染2份。
3讨论
本研究较系统地对我国东南沿海三省门诊病例中常见的5种腹泻病毒及其混合感染情况进行了监测。检出任一病原阳性标本阳性比例为43.5%，其中轮状病毒（25.5%）和诺如病毒（18.4%）是导致儿童腹泻最主要的两种病毒，札如病毒为4.4%，肠道腺病毒（2.7%）和星状病毒（1.2%）感染比例相对最低。
A组轮状病毒是感染急性腹泻的最主要病原，且经常引起儿童的严重腹泻，轮状病毒根据不同的抗原和遗传特性分为A～G共7组，其中A、B、C组与人类感染有关[4]。诺如病毒在流行性和散发性腹泻中都扮演着重要角色，并且在各年龄组都能引起病毒性腹泻的发生[5]，但目前为止还没有能治疗诺如病毒性腹泻的方法。札如病毒能够在5岁以下儿童病例中引起小规模的流行，但症状往往比诺如病毒的轻[6]。近年的研究表明，肠道腺病毒能够增加免疫力低下人群的腹泻发病率，并能够延长患者住院时间[2]。星状病毒则被证实是引起儿童、老年人以及免疫力低下患者的重要感染病原之一[3]。
我国以5岁以下儿童为基础的RV腹泻监测网全年系统监测结果表明，中国门诊腹泻患儿的RV中位阳性比例为29%（范围：15%～35%）[4]，本次监测结果与之相符，其中A组轮状病毒是门诊腹泻患儿感染最多的病原。研究表明，轮状病毒流行毒株在不同年份、不同地区存在差异[4，7]，G1、G2、G3、G4毒株和P[8]为感染人类的主要型别，我国近年来的的优势毒株为G3型和P[8]型。本次研究G分型结果显示， G3比例最高，占37.9%，但G1的比例达到了32.75%，接近G3，提示G1的感染和G3同样重要。近些年，G9型轮状病毒已经成为世界范围内一种常见的毒株[2-4，7]，我国5岁以下住院儿童G9的感染率为4%[4]，而本次门诊病例的监测中发现G9的感染率达到4.3%，提示在我国，无论是住院还是门诊患儿G9型的监测都有重要的意义。P 分型中，P [8] 型最多，占57.8%，其他型别比例较少，尤其值得注意的是，我们还分离到2株P[10]基因型标本，占1.7%（2/116），这是该地区的首次报道。之前的文献报道各种G、P 型组合的分布具有较大的差异[4，8]，本次监测中以G3P [8]组合为主（27.59%），其次是G1P [8] （16.4%），G1P [4] （6.0%） 和G4P [8] （5.2%），应该提出的是，G2P[4]作为世界上四种常见的组合之一[9]。在本研究中仅占2.6%。另外，近年来一些国家和地区出现了一些既往少见型别如G5、G6、G8、G10和G12以及一些不常见的组合[10]。这些轮状病毒流行株的不断变化意味着轮状病毒抗原之间存在广泛的变异性，提示持续不断地监测轮状病毒的分子流行病学变化能够为研究轮状病毒地区间的传播关系、阐明毒株的地理分布提供科学依据。 据全国病毒性腹泻监测网络对我国11个省份5岁以下腹泻儿童的监测，我国2007年诺如病毒阳性比例大约为15%，和往年基本一致。东南沿海地区为诺如病毒高发区[11，12]，曾玫等2010年对我国五所城市的医院门诊腹泻患儿连续一年的流行病学调查，结果我国东南部城市上海、杭州和广州的门诊病例中诺如病毒阳性比例分别为14.9%、20.0%和17.9%，三个地区总阳性比例为17.6%（494/2804）[13，14]。我们的结果（阳性比例为18.4%）与以上的研究结果接近，但高于国内住院患儿诺如病毒感染率（大约8.9%～10.3%）[11-13]；和一些发达国家相比，我们的结果偏高，如美国7.4%和日本13.2%[15，16]。可能与以下因素有关：首先，诺如病毒主要经粪-口传播，通过污染的水源和食物、空气以及人与人的直接接触传播，甚至有报道广泛污染的环境表面也可能在诺如病毒爆发中起着重要的作用[13-15]，作为一个发展中国家，我国的卫生条件较发达国家差距较大，为诺如病毒的传播提供了有利的条件。另外，诺如病毒常在人口聚集区引起集体暴发，而据统计，我国东南部的人口密度达到了362.8人/平方公里（人口基数来源于2008年底），远远高于其他国家和地区，成为诺如病毒感染的另一有利条件。
诺如病毒GII基因型比GI 型更为流行[14]，本研究中GII基因型占绝大部分78.9%，GI 型仅占19.7%，与Blanton LH等研究结果较吻合[17]，他们利用RT-PCR方法进行诺如病毒分型，结果GII基因型占79%，GI 型占19%。与诺如病毒研究相比，国内关于札如病毒系统的流行病学研究比较少，针对门诊病例的研究更是缺乏。札如病毒感染在世界范围内均有分布，感染率为0.3%～9.3%[18，19]。我国兰州地区2003～2007年住院患儿急性腹泻患儿阳性率为1.13%，而中国疾控中心对我国九省市住院患儿札如病毒流行情况的调查结果显示，我国急性腹泻患儿札如病毒总阳性比例仅为0.9%，明显低于国外研究。我们的研究结果（4.4%）与之较为接近，但比国内住院患儿感染率高，并且也超过肠道腺病毒（2.71%）与星状病毒（1.23%）成为我国东南沿海门诊病例中第三位的重要病毒。可能是因为札如病毒引起的腹泻症状轻，且有自限性[20，21]。腺病毒和星状病毒则易引起重型腹泻从而导致患儿住院治疗[2， 21]。我国应该加强以门诊或社区为单位的监测，以求能更合理地反映我国札如病毒的疾病负担。
本次监测结果中混合感染情况复杂，多达9种组合，阳性比例达到8.0%。值得注意的是，我们发现了4份（0.5%，4/811）标本为3种病毒混合感染，其中3份为轮状病毒、诺如病毒和肠道腺病毒混合感染，1份为轮状病毒、札如病毒和肠道腺病毒感染。近年来，3种病毒同时感染的现象在其他不同的研究中也不断地被报道出来，而且组合的种类越来越多[4， 22]。虽然病毒之间的相互组合对疾病严重程度是否有增强作用尚存争议，但是混合感染的存在已经是一个不容忽视的问题[23]。以上结果告诉我们一方面要加强病毒性腹泻中混合感染情况的监测，另一方面也要重视开展涉及病原范围更广（包括细菌、病毒、甚至寄生虫）的流行病学以及临床病理学研究，以更好地了解我国急性感染性腹泻的本地资料。
五种病毒及其混合感染均无性别差异。病毒性腹泻高发年龄是7～24月龄，2岁以下患儿占95.5%（337/353）。国内外研究提示2岁以下儿童是轮状病毒和诺如病毒的易感人群[4，23，24]，本研究中轮状病毒以7～24月龄感染率（21.1%）最高，高于1～6月龄（15.0%）和25～60月龄（5.3%），该结论一方面支持了母体抗体对轮状病毒感染具有保护作用的观点，另一方面也提示2周岁以下的低龄儿童应为轮状病毒疫苗的施治的重点人群。通过比较发现，轮状病毒感染平均月龄为（10.76±7.19）个月，小于诺如病毒平均月龄（13.71±9.61）个月（P = 0.009），说明儿童中诺如病毒感染年龄比轮状病毒感染年龄偏大[20]。既往的研究显示札如病毒腹泻发病年龄主要在5岁以下[21]，本次研究中未发现7～12月龄患儿，其他各年龄组之间阳性比例无统计学差异。肠道腺病毒感染全部发生在2岁以下的儿童中，一方面，该结果可能是受到了2岁以上有限的监测病例（仅有57例，占7.0%）的影响，从而与真实情况存在偏差，且星状病毒感染也全部发生在2岁以下的儿童中。2岁以上儿童较2岁以下儿童混合感染率高（P < 0.001），能否说明儿童中高年龄组易发混合感染有待进一步研究验证。
总之，这是第一次在我国东南地区开展的多中心的同时利用ELISA和多重PCR技术对门诊病例中病毒性腹泻患儿的病原学监测，不仅清晰地说明了我国东南地区五种常见腹泻病毒及其混合感染的流行状况，而且科学地阐明我国病毒性腹泻的流行规律、发病状况和疾病负担，为临床进一步研究提供了必需的本地资料。为了更加准确地了解我国病毒性腹泻的疾病负担以及有针对性地开发、改进疫苗，长期和广泛的监测研究是十分必要的。
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（收稿日期：2013-03-18）
[关键词] 肠道病毒；急性腹泻；混合感染
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急性腹泻是世界范围内的一个不容忽略的公共卫生问题，在发展中国家，每年共有两百万人的死亡与急性腹泻有关，其中主要是婴幼儿[1]。随着抗生素的广泛应用，加之人们卫生习惯的改善，细菌性腹泻和寄生虫性腹泻感染已有所降低[2]，但是病毒性腹泻没有得到有效的控制。轮状病毒（Rotavirus，RV）、诺如病毒（Norovirus，NoV）、札如病毒（Sapovirus，SaV）、肠道腺病毒（Adenovirus，AdV）、星状病毒（Astrovirus，AstV）是引起婴幼儿病毒性腹泻最主要的五种病原[3]。本研究的目的是了解浙江省5岁以下门诊腹泻患儿中五种常见病毒以及混合感染的分布情况，为我国的病毒性腹泻的防控工作提供有价值的流行病学和临床治疗的数据支持。
1 材料与方法
1.1资料来源
本研究选取浙江省5家医院作为监测哨点（浙江大学医学院附属第一医院、浙江大学医学院附属儿童医院、浙江大学医学院附属第一医院北仑分院、湖州市中心医院和浙江中医药大学附属第一医院）。随机收集2010年1～12月期间5家哨点医院门诊病例中5岁以下（含5岁）急性腹泻患儿的粪便标本811份。标本采集对象均符合每日排便3次或以上，且大便性状有改变（呈水样便、稀便）。每个患者只采集一份粪便标本，标本采集时间覆盖全年各月，每周均有采集；在进行核酸提取之前，所有标本都储存在-80℃。
1.2核酸的提取
将粪便标本在标本处理液（PBS液）中按1：10比例稀释后，再以8 000转/min离心5 min，最后留取上清液于-20℃待测。取200～400 μL处理好的粪便标本上清液，使用台湾Geneaid 公司生产的商品化核酸提取试剂盒（货号：VR100）对标本上清液进行核酸提取，操作方法详见试剂盒说明书。
1.3检测方法
1.3.1 A组轮状病毒检测及其G、P基因分型 采用DAKO轮状病毒ELISA检测试剂盒检测粪便上清液中的A组轮状病毒，操作步骤详见试剂盒说明书。对A组轮状病毒阳性的标本进一步采用一个两步扩增的逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）进行G、P基因分型，方法同以前研究[4]。G基因分型在第一步扩增中使用Beg9 （forward）/End9 （reverse）作为一对引物扩增出一条1 062 bp的基因片段，该片段在第二步扩增体系中作为鉴定G1、G2、G3、G4、G8和 G9型别的模板；P基因分型中第一步扩增中则使用一个引物对-Con3/Con2扩增一条876 bp的基因片段，作为第二步扩增的模板，鉴定P[4]、P[6]、P[8]、P[9]和P[10]。
1.3.2 B/C组轮状病毒、诺如病毒（GI和GII）、札如病毒、肠道腺病毒、星状病毒多重PCR检测 将提取的病毒核酸应用随机引物（NO： C1181， Promega， USA）合成病毒cDNA，条件为50℃逆转录1 h，99℃灭活逆转录酶5 min后，然后迅速放入冰内冷却。然后以合成的cDNA为模板，进行B/C组轮状病毒、诺如病毒（GI和GII）、札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒的多重PCR检测。多重PCR在25μL反应体系中进行，包括10×Taq Buffer 2.5 μL，2.5 mol/L dNTP 2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，5 U/μLTaq DNA聚合酶0.125 μL，7对病毒特异性引物（表1）（各33 μmol/L，0.2 μL）的混合物，模板核酸（除肠道腺病毒为DNA，其他均为cDNA）2.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反应条件为94℃预变性5 min，然后在94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min条件下进行35个循环，最后以72℃终延伸7 min，4℃下终止反应。最后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.4统计学方法
利用SPSS18.0和Excel软件进行统计学分析，不同组别的患者和不同病毒的感染率等变量之间的差异采用两独立样本t检验和χ2检验分析，检验统计采用95%的可信区间（P = 0.05），P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 检测结果
811份标本中， 353份（43.53%）检出一种或一种以上病毒，其中288份为单病毒感染，占35.51%（288/811），混合感染65份，占8.01%（65/811），总体来看，轮状病毒是引起儿童腹泻最主要的病毒，共207份标本检出，占25.52%（207/811），其次是诺如病毒占18.37%（147/811），札如病毒占4.44%（36/811），肠道腺病毒和星状病毒检出率阳性比例较低，分别占2.71%（22/811）和1.23%（10/811）。 单病毒感染中轮状病毒、诺如病毒、札如病毒、肠道腺病毒与星状病毒的阳性比例分别是18.4% （149/811）、 12.6% （102/811）、6.5% （23/811）、2.8% （10/811）和0.5% （4/811）。轮状病毒是混合感染中最常见的病毒（89.23%，58/65），轮状病毒和诺如病毒是两两混合感染中最常见的组合，共37例，占4.6%，其次是轮状病毒和札如病毒混合感染，共10例（1.2%），其他两种病毒混合感染情况的阳性比例均小于0.5%。此外，我们还发现3份标本为轮状病毒、诺如病毒和肠道腺病毒3种病毒同时感染，1份为轮状病毒、札如病毒和肠道腺病毒混合感染。
图1 病毒检测结果分布。
（A） 353例病毒检测阳性结果分布； （B） 65例混合感染分布
（RV， rotavirus； NoV， norovirus； SaV， sapovirus； AdV， adenovirus； AstV， astrovirus）.
2.2 性别和年龄分布
811例≤5 岁腹泻患儿中，男547例，女264例，平均年龄（12.76±11.15）个月，年龄范围1～60月龄（表2）。轮状病毒感染平均月龄为（10.76±7.19）个月，比诺如病毒平均月龄（13.71±9.61）低（P = 0.009）。轮状病毒在7～12月龄组患儿中阳性比例最高，与其他年龄组相比，差异有统计学意义（χ2=12.203，P < 0.01），25～60月龄组阳性比例（5.26%）最低；诺如病毒感染发病高峰在13～24月龄组，较其他年龄组高（χ2=8.565，P = 0.003），但是在13～24月龄组无札如病毒检出；肠道腺病毒和星状病毒感染全部发生于24月龄组以下儿童；混合感染中2岁以上患儿的阳性比例较2岁以下儿童高（P < 0.01）。见表2。
2.3病毒的基因分型
206份轮状病毒阳性标本中，均为A组轮状病毒，未发现B和C组轮状病毒，A组轮状病毒标本中的116份做了进一步的G、P基因型鉴定，结果G3型44份（37.93%），G1型38份（32.75%），G4型6份（5.17%），G2型6份（5.17%），G9型5份（4.31%），检出G1和G3型混合感染1份（0.86%），未确定型别16份（13.79%）；P[8]基因型 67份（57.76%），P[4] 型17份（14.66%）、P[6]型5份（4.31%）、P[10] 型2份（1.72%）和P[9]型1份（0.86%），未确定P基因型24份（20.69%）。见表3。
G、P基因型组合以P[8]G3组合为主，占27.59%（32/116），其次是P[8]G1，占16.38%（19/116），P[4]G1占6.03%，P[8]G4占5.17%。
此外，147份诺如病毒阳性标本包括GII基因型116份（占78.91%），G I基因型29份（占19.73 %），GI和GII型混合感染2份。
3讨论
本研究较系统地对我国东南沿海三省门诊病例中常见的5种腹泻病毒及其混合感染情况进行了监测。检出任一病原阳性标本阳性比例为43.5%，其中轮状病毒（25.5%）和诺如病毒（18.4%）是导致儿童腹泻最主要的两种病毒，札如病毒为4.4%，肠道腺病毒（2.7%）和星状病毒（1.2%）感染比例相对最低。
A组轮状病毒是感染急性腹泻的最主要病原，且经常引起儿童的严重腹泻，轮状病毒根据不同的抗原和遗传特性分为A～G共7组，其中A、B、C组与人类感染有关[4]。诺如病毒在流行性和散发性腹泻中都扮演着重要角色，并且在各年龄组都能引起病毒性腹泻的发生[5]，但目前为止还没有能治疗诺如病毒性腹泻的方法。札如病毒能够在5岁以下儿童病例中引起小规模的流行，但症状往往比诺如病毒的轻[6]。近年的研究表明，肠道腺病毒能够增加免疫力低下人群的腹泻发病率，并能够延长患者住院时间[2]。星状病毒则被证实是引起儿童、老年人以及免疫力低下患者的重要感染病原之一[3]。
我国以5岁以下儿童为基础的RV腹泻监测网全年系统监测结果表明，中国门诊腹泻患儿的RV中位阳性比例为29%（范围：15%～35%）[4]，本次监测结果与之相符，其中A组轮状病毒是门诊腹泻患儿感染最多的病原。研究表明，轮状病毒流行毒株在不同年份、不同地区存在差异[4，7]，G1、G2、G3、G4毒株和P[8]为感染人类的主要型别，我国近年来的的优势毒株为G3型和P[8]型。本次研究G分型结果显示， G3比例最高，占37.9%，但G1的比例达到了32.75%，接近G3，提示G1的感染和G3同样重要。近些年，G9型轮状病毒已经成为世界范围内一种常见的毒株[2-4，7]，我国5岁以下住院儿童G9的感染率为4%[4]，而本次门诊病例的监测中发现G9的感染率达到4.3%，提示在我国，无论是住院还是门诊患儿G9型的监测都有重要的意义。P 分型中，P [8] 型最多，占57.8%，其他型别比例较少，尤其值得注意的是，我们还分离到2株P[10]基因型标本，占1.7%（2/116），这是该地区的首次报道。之前的文献报道各种G、P 型组合的分布具有较大的差异[4，8]，本次监测中以G3P [8]组合为主（27.59%），其次是G1P [8] （16.4%），G1P [4] （6.0%） 和G4P [8] （5.2%），应该提出的是，G2P[4]作为世界上四种常见的组合之一[9]。在本研究中仅占2.6%。另外，近年来一些国家和地区出现了一些既往少见型别如G5、G6、G8、G10和G12以及一些不常见的组合[10]。这些轮状病毒流行株的不断变化意味着轮状病毒抗原之间存在广泛的变异性，提示持续不断地监测轮状病毒的分子流行病学变化能够为研究轮状病毒地区间的传播关系、阐明毒株的地理分布提供科学依据。 据全国病毒性腹泻监测网络对我国11个省份5岁以下腹泻儿童的监测，我国2007年诺如病毒阳性比例大约为15%，和往年基本一致。东南沿海地区为诺如病毒高发区[11，12]，曾玫等2010年对我国五所城市的医院门诊腹泻患儿连续一年的流行病学调查，结果我国东南部城市上海、杭州和广州的门诊病例中诺如病毒阳性比例分别为14.9%、20.0%和17.9%，三个地区总阳性比例为17.6%（494/2804）[13，14]。我们的结果（阳性比例为18.4%）与以上的研究结果接近，但高于国内住院患儿诺如病毒感染率（大约8.9%～10.3%）[11-13]；和一些发达国家相比，我们的结果偏高，如美国7.4%和日本13.2%[15，16]。可能与以下因素有关：首先，诺如病毒主要经粪-口传播，通过污染的水源和食物、空气以及人与人的直接接触传播，甚至有报道广泛污染的环境表面也可能在诺如病毒爆发中起着重要的作用[13-15]，作为一个发展中国家，我国的卫生条件较发达国家差距较大，为诺如病毒的传播提供了有利的条件。另外，诺如病毒常在人口聚集区引起集体暴发，而据统计，我国东南部的人口密度达到了362.8人/平方公里（人口基数来源于2008年底），远远高于其他国家和地区，成为诺如病毒感染的另一有利条件。
诺如病毒GII基因型比GI 型更为流行[14]，本研究中GII基因型占绝大部分78.9%，GI 型仅占19.7%，与Blanton LH等研究结果较吻合[17]，他们利用RT-PCR方法进行诺如病毒分型，结果GII基因型占79%，GI 型占19%。与诺如病毒研究相比，国内关于札如病毒系统的流行病学研究比较少，针对门诊病例的研究更是缺乏。札如病毒感染在世界范围内均有分布，感染率为0.3%～9.3%[18，19]。我国兰州地区2003～2007年住院患儿急性腹泻患儿阳性率为1.13%，而中国疾控中心对我国九省市住院患儿札如病毒流行情况的调查结果显示，我国急性腹泻患儿札如病毒总阳性比例仅为0.9%，明显低于国外研究。我们的研究结果（4.4%）与之较为接近，但比国内住院患儿感染率高，并且也超过肠道腺病毒（2.71%）与星状病毒（1.23%）成为我国东南沿海门诊病例中第三位的重要病毒。可能是因为札如病毒引起的腹泻症状轻，且有自限性[20，21]。腺病毒和星状病毒则易引起重型腹泻从而导致患儿住院治疗[2， 21]。我国应该加强以门诊或社区为单位的监测，以求能更合理地反映我国札如病毒的疾病负担。
本次监测结果中混合感染情况复杂，多达9种组合，阳性比例达到8.0%。值得注意的是，我们发现了4份（0.5%，4/811）标本为3种病毒混合感染，其中3份为轮状病毒、诺如病毒和肠道腺病毒混合感染，1份为轮状病毒、札如病毒和肠道腺病毒感染。近年来，3种病毒同时感染的现象在其他不同的研究中也不断地被报道出来，而且组合的种类越来越多[4， 22]。虽然病毒之间的相互组合对疾病严重程度是否有增强作用尚存争议，但是混合感染的存在已经是一个不容忽视的问题[23]。以上结果告诉我们一方面要加强病毒性腹泻中混合感染情况的监测，另一方面也要重视开展涉及病原范围更广（包括细菌、病毒、甚至寄生虫）的流行病学以及临床病理学研究，以更好地了解我国急性感染性腹泻的本地资料。
五种病毒及其混合感染均无性别差异。病毒性腹泻高发年龄是7～24月龄，2岁以下患儿占95.5%（337/353）。国内外研究提示2岁以下儿童是轮状病毒和诺如病毒的易感人群[4，23，24]，本研究中轮状病毒以7～24月龄感染率（21.1%）最高，高于1～6月龄（15.0%）和25～60月龄（5.3%），该结论一方面支持了母体抗体对轮状病毒感染具有保护作用的观点，另一方面也提示2周岁以下的低龄儿童应为轮状病毒疫苗的施治的重点人群。通过比较发现，轮状病毒感染平均月龄为（10.76±7.19）个月，小于诺如病毒平均月龄（13.71±9.61）个月（P = 0.009），说明儿童中诺如病毒感染年龄比轮状病毒感染年龄偏大[20]。既往的研究显示札如病毒腹泻发病年龄主要在5岁以下[21]，本次研究中未发现7～12月龄患儿，其他各年龄组之间阳性比例无统计学差异。肠道腺病毒感染全部发生在2岁以下的儿童中，一方面，该结果可能是受到了2岁以上有限的监测病例（仅有57例，占7.0%）的影响，从而与真实情况存在偏差，且星状病毒感染也全部发生在2岁以下的儿童中。2岁以上儿童较2岁以下儿童混合感染率高（P < 0.001），能否说明儿童中高年龄组易发混合感染有待进一步研究验证。
总之，这是第一次在我国东南地区开展的多中心的同时利用ELISA和多重PCR技术对门诊病例中病毒性腹泻患儿的病原学监测，不仅清晰地说明了我国东南地区五种常见腹泻病毒及其混合感染的流行状况，而且科学地阐明我国病毒性腹泻的流行规律、发病状况和疾病负担，为临床进一步研究提供了必需的本地资料。为了更加准确地了解我国病毒性腹泻的疾病负担以及有针对性地开发、改进疫苗，长期和广泛的监测研究是十分必要的。
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（收稿日期：2013-03-18）