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[摘要]采用磷脂脂肪酸（PLFA）分析方法，在实验室模拟条件下研究了柴油14d胁迫对湿地土壤微生物群落的影响，结果表明：受到胁迫之后，根际土壤中的微生物活性显著高于非根际土壤。说明根际微生物对柴油污染具有更强的抵抗力，其中芦苇根际土壤微生物对柴油的短期胁迫的承受能力最强，其根际土壤的微生物活性提高到了胁迫前的2倍以上。特征脂肪酸和主成分分析显示，柴油的短期胁迫已经大幅改变了土壤的微生物群落结构，柴油胁迫对土壤微生物群落的影响强于湿地植物的根际效应，但相比其他湿地植物，芦苇的根际效应对土壤微生物群落具有主导作用，根际效应大幅强化了土壤中微生物抵御柴油短期胁迫的能力，可以将其作为油污湿地环境修复的优势植物。
[关键词]柴油 湿地植物 根际 土壤微生物群落 磷脂脂肪酸
[中图分类号] TE991 [文献码] B [文章编号] 1000-405X（2013）-10-185-2
1引言（Introduction）
生物修复是消除石油烃和其他烃类污染物的基本途径之一（Harayama et al.，2004）。研究显示含油污水灌溉刺激了稻田土壤中好氧异养细菌（AHB）和真菌的生长（李慧等，2005）。石油烃浓度较低时可以促进油菜生长，但是严重影响土壤中的微生物种类数量（李洪梅等，2010）。因此，研究石油污染土壤中微生物的群落结构特征的变化具有重要的理论和现实意义。
磷脂脂肪酸分析技术是一种不需要经过培养就能获得用于原位微生物群落结构的方法。磷脂脂肪酸（PLFAs）存在于活细胞的细胞膜中，在细胞死亡后很快被分解，因此其含量能反映微生物的活性。不同属的微生物通过不同生化途径而形成不同的PLFAs（Wu，2006），具有属的特异性。其组成及含量显示出极大的差异，可用来直接估价其微生物的生物量及群落结构，是一种较为准确、有效的研究方法（Zelles，1994；Guckert，1986）。本文以黄浦江-长江口沿岸湿地为研究区，选择土著植物藨草、香附子、茭白、芦苇为供试植物，采集根际土壤，分析不同植物根际土壤的微生物群落结构，并在实验室模拟条件下，研究柴油污染对根际土壤微生物群落结构的影响，探讨石油污染土壤中根际微生群落的变化及生物降解效应。来评价石油烃污染土壤的植物修复可行性，为油污湿地植物修复提供理论和技术支持。
2材料与方法（Materials and methods）
2.1样品采集与处理
研究样品采自黄浦江-长江口江岸湿地（N31°23’，E121°30’），藨草（Scirpus tripueter）、香附子（Cyperus rotundus）、茭白（Zizania latifolia）与芦苇（Phragmites australis）是该区标志性植物群种。采样样品采集选择以上四种代表性植物，采集粘附或紧临根系的土样及没有植物生长的样品，取样深度5～20cm。挑除土壤样品中较大的杂质后，真空冷冻干燥后，过孔径<2mm的筛子，存放于-80℃冰箱内供微生物分析测试使用。
2.2模拟实验设计
模拟实验采用50mL锥形瓶，分别加入20g根际土和20g油污土，混合后加入无菌蒸馏水补充水分，不在添加营养物质，并加入0.64g柴油作为污染物，使混合土壤中的TPH含量为16000mg/kg。28℃避光静置培养14d，培养结束后，冷冻干燥。
2.3测定方法
2.3.1微生物活性
各种植物根系土壤的微生物活性以荧光素双醋酸酯（FDA）法测定（俞毓馨等，1990）。结果表示为abs·（g.2h）-1（干重），以此来量化土壤中微生物活性。
2.3.2PLFA的提取
采用稍加修改的Bligh和Dyer法提取和分析PLFA（Bligh and Dyer，1959）：称取3g冷冻干燥的土样，以混合单相提取剂（氯仿：甲醇：柠檬酸比为1：2：0.8，v/v）提取，固相萃取分离磷脂。温和碱性甲酯化生成脂肪酸甲酯，進行GC-MS分析。
2.4数据处理
研究结果为3次重复实验的平均值，采用Excel 2003和SPSS 17.0软件进行单因子方差分析（One-way ANOVA）（李志辉等，2003）。
3结果与讨论（Results and discussion）
3.1柴油对微生物活性的影响
本实验中原始的5种土样中藨草根际的微生物活性最高，高于其他土样0.1abs·（g.2h）-1以上。而土样之间微生物活性差别不大，无论是根际与非根际土，还是不同植物的根际土之间均无显著性差异（P<0.05），未表现出明显的根际效应。比较胁迫前后的土壤微生物活性可以看出，经过14d之后，土壤微生物的活性显著提高，其中芦苇根际土壤的微生物活性提高了约0.2abs·（g.2h）-1，达到了原始土样的2倍以上。表明研究区域的土壤微生物对柴油的短期胁迫具有一定的承受能力。比较14d后的5种土样中微生物活性可以发现，根际土壤中的微生物活性显著高于非根际土壤，不同根际土样之间也存在显著性差异（P<0.05）。说明湿地植物可以比较显著地改善受污染土壤的微生物活性，有利于提高油污沉积物的植物修复能力。许多其他的研究也显示植物根系能够增加受污染土壤中微生物的数量与活性（陈嫣等，2005；林学政等，2005；Liuetal.，2011）。在本实验的研究区域中，柴油胁迫后，芦苇根际土中微生物活性最高，可以将其作为生态修复的优势植物。
3.2柴油对土壤PLFA组成的影响
各种土壤样品中共鉴定出磷脂脂肪酸29种，碳链长度从12到24，包括饱和、不饱和及支链脂肪酸。其中11种PLFA（i14：0、14：0、i15：0、15：0、16：1ω7c、16：0、i17：0、17：0、18：0、i20：0、22：0）在5种原始土样中均被检测到，5种原始土样中分别检测到20、19、22、22和21种单体PLFA，并未表现出明显的差异，与微生物活性的分析结果一致。在各种PLFA中，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸占大多数，含量占总量的80%以上，其中12：0、16：0和16：1ω7c是主要的单体PLFA，根际土壤中单不饱和脂肪酸的比例显著高于非根际土壤（P<0.05）。5种受胁迫后的土样中共检测到22种单体PLFA。比较胁迫前后土壤中PLFA的组成可以发现，受到柴油胁迫后土壤中PLFA的种类明显减少，其中无植物土壤中仅检测到2种PLFA，而芦苇根际土壤受柴油影响较小，其中仍检测到18种单体PLFA。 分析PLFA的种类可以发现，受到胁迫前后土壤中PLFA组成也显著变化（P<0.05），不饱和脂肪酸的比例下降了20%，7种PLFA（i17：1ω5t、17：1ω7c、18：2ω6，9c、18：1ω7t、18：1ω10t、20：4w6，9，12，15c和20：5w3，6，9，12，15c）在胁迫前的土样中检测出，但在胁迫后的土样中未检测到，其中i17：1ω5t仅在茭白和芦苇根际土样中检测出，20：4w6，9，12，15c和20：5w3，6，9，12，15c仅在香附子根际土样中检测出。而在胁迫后的芦苇根际土壤中检测到2种原土中未检测到的PLFA（16：1ω5t和cy17：0）。16：1ω5t和cy17：0在胁迫后的其他土样中并未检测出，说明柴油的短期胁迫对根际土壤微生物群落的影响在不同植物间也具有显著的差异（P<0.05）。
比较生物多样性指数可知，柴油对土壤PLFA多样性产生显著影响，无植物土壤中PLFA多样性仅为胁迫前的1/3。不同根际土壤中PLFA多样性在胁迫之前存在显著性差异（P<0.05），受到柴油胁迫之后香附子和茭白根际土壤中PLFA多样性都大幅下降。而藨草和芦苇根际土样中的PLFA多样性略微上升，其中藨草和香附子、茭白根际土样中的PLFA多样性指数接近，说明柴油胁迫对土壤PLFA组成的影响强于大部分植物的根际效应。
3.3柴油对土壤微生物群落结构的影响
由于不同微生物体酶系不同，致使不同的生物体遗传有特定脂肪酸，因此特征脂肪酸是不同微生物类群的生物标志物，某些脂肪酸的比值是反映微生物群落结构特征的重要依据（Soderberg，2004）。
分析实验结果，各种特征脂肪酸的含量在不同原始土样中存在显著差异（P<0.05），根际土壤中特征脂肪酸的总量明显高于非根际土壤，其中藨草和香附子根际较其他植物含有更多的特征脂肪酸。比较不同的特征脂肪酸可以发现，原始土样中细菌和革兰氏阴性菌脂肪酸含量远高于真菌和革兰氏阳性菌。不同特征脂肪酸之间的比例在各种原始土样中变化并不大，说明间就区域不同土壤中的微生物结构比较接近。
比较柴油胁迫前后土样中特征脂肪酸的变化可以发现，除芦苇根际土壤外，受胁迫后的土壤中特征脂肪酸含量显著降低（P<0.05），其中无植物土壤中4类特征脂肪酸全部消失，这一结果与之前的分析结果一致。比较不同的特征脂肪酸可以发现，细菌和革兰氏阴性菌脂肪酸所占的比例进一步增加，说明研究区域土壤中对石油烃类物质具有降解作用的微生物主要是革兰氏阴性细菌，这与许多已有的研究结果相吻合（赵玉恒等，2006）。
比较受胁迫后的不同土样，可以发现不同土样中的特征脂肪酸含量存在显著性差异（P<0.05），与之前的实验结果相似的是，芦苇根际土壤PLFA含量在受到柴油的短期胁迫后出现了大量增加的现象。其中细菌脂肪酸的含量增加了3倍，革兰氏阳性菌脂肪酸甚至增加了近15倍，芦苇根际土壤中对柴油的降解可能主要由革兰氏阳性细菌贡献。不同土壤微生物群落在柴油胁迫下表现出不同的变化，其中芦苇根际微生物对柴油表现出很强的耐受能力，能够在高浓度柴油污染的土壤中大量生长，可以将其作为油污湿地环境修复的优势植物。
4结论（Conclusions）
本文研究了柴油短期胁迫对黄浦江-长江口沿岸湿地研究区土壤微生物群落的影响，研究证明柴油胁迫明显改变了土壤微生物群落结构：
（1）原始的5种土样中藨草根际的微生物活性最高，其他土样之间无显著性差异（P<0.05）。受到胁迫之后，土壤微生物的活性提高，其中芦苇根际土壤的微生物活性提高到了原土的2倍以上，根际土壤中的微生物活性均显著高于非根际土壤。说明根际微生物对柴油污染具有跟强的抵抗力，其中蘆苇根际土壤微生物对柴油的短期胁迫的承受能力最强。
（2）受到柴油胁迫后土壤中PLFA的种类明显减少，其中无植物土壤受到的影响最为明显，而芦苇根际土壤受柴油影响较小。受到胁迫前后土壤中PLFA组成也显著变化（P<0.05），不饱和脂肪酸的比例下降了20%，而且对不同植物的影响程度具有显著的差异（P<0.05）。
（3）土壤PLFA多样性指数分析显示，不同根际土壤中PLFA多样性在胁迫之前存在显著性差异（P<0.05），但在柴油胁迫之后藨草、香附子和茭白根际土样中的PLFA多样性接近，说明柴油胁迫对土壤PLFA组成的影响强于大部分植物的根际效应。
参考文献
[1]陈嫣，李广贺，张旭等.2005.石油污染土壤植物根际微生态环境与降解效应[J].清华大学学报（自然科学版），45（6）：784～787.
[2]李洪梅，郜玉环，江丽华等.2010.不同浓度石油烃对油菜产量、土壤中石油烃残留量及土壤微生物的影响[J].中国农学通报.26（17）：382～385.
[3]李慧，陈冠雄，杨涛等.2005.沈抚灌区含油污水灌溉对稻田土壤微生物种群及土壤酶活性的影响[J].应用生态学报.16（7）：1355～1359.
[4]林学政，沈继红，刘克斋等.2005.种植盐地碱蓬修复滨海盐渍土效果的研究.海洋科学进展.23（1）：65～69.
[5]李志辉，罗平.2003.统计分析教程（第二版）[M].北京：电子工业出版社.310～320.
[6]Wu Y P，Xu J M，Wang H Z. 2006.Application of Sherlock MIS in identification of soil bacteria. Acta Pedologica Sinica，43（4）：642～647.
[7]Zelles L，Bai Q Y.1993.Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS.Soil Biol.Biochem，25：495～507.
[关键词]柴油 湿地植物 根际 土壤微生物群落 磷脂脂肪酸
[中图分类号] TE991 [文献码] B [文章编号] 1000-405X（2013）-10-185-2
1引言（Introduction）
生物修复是消除石油烃和其他烃类污染物的基本途径之一（Harayama et al.，2004）。研究显示含油污水灌溉刺激了稻田土壤中好氧异养细菌（AHB）和真菌的生长（李慧等，2005）。石油烃浓度较低时可以促进油菜生长，但是严重影响土壤中的微生物种类数量（李洪梅等，2010）。因此，研究石油污染土壤中微生物的群落结构特征的变化具有重要的理论和现实意义。
磷脂脂肪酸分析技术是一种不需要经过培养就能获得用于原位微生物群落结构的方法。磷脂脂肪酸（PLFAs）存在于活细胞的细胞膜中，在细胞死亡后很快被分解，因此其含量能反映微生物的活性。不同属的微生物通过不同生化途径而形成不同的PLFAs（Wu，2006），具有属的特异性。其组成及含量显示出极大的差异，可用来直接估价其微生物的生物量及群落结构，是一种较为准确、有效的研究方法（Zelles，1994；Guckert，1986）。本文以黄浦江-长江口沿岸湿地为研究区，选择土著植物藨草、香附子、茭白、芦苇为供试植物，采集根际土壤，分析不同植物根际土壤的微生物群落结构，并在实验室模拟条件下，研究柴油污染对根际土壤微生物群落结构的影响，探讨石油污染土壤中根际微生群落的变化及生物降解效应。来评价石油烃污染土壤的植物修复可行性，为油污湿地植物修复提供理论和技术支持。
2材料与方法（Materials and methods）
2.1样品采集与处理
研究样品采自黄浦江-长江口江岸湿地（N31°23’，E121°30’），藨草（Scirpus tripueter）、香附子（Cyperus rotundus）、茭白（Zizania latifolia）与芦苇（Phragmites australis）是该区标志性植物群种。采样样品采集选择以上四种代表性植物，采集粘附或紧临根系的土样及没有植物生长的样品，取样深度5～20cm。挑除土壤样品中较大的杂质后，真空冷冻干燥后，过孔径<2mm的筛子，存放于-80℃冰箱内供微生物分析测试使用。
2.2模拟实验设计
模拟实验采用50mL锥形瓶，分别加入20g根际土和20g油污土，混合后加入无菌蒸馏水补充水分，不在添加营养物质，并加入0.64g柴油作为污染物，使混合土壤中的TPH含量为16000mg/kg。28℃避光静置培养14d，培养结束后，冷冻干燥。
2.3测定方法
2.3.1微生物活性
各种植物根系土壤的微生物活性以荧光素双醋酸酯（FDA）法测定（俞毓馨等，1990）。结果表示为abs·（g.2h）-1（干重），以此来量化土壤中微生物活性。
2.3.2PLFA的提取
采用稍加修改的Bligh和Dyer法提取和分析PLFA（Bligh and Dyer，1959）：称取3g冷冻干燥的土样，以混合单相提取剂（氯仿：甲醇：柠檬酸比为1：2：0.8，v/v）提取，固相萃取分离磷脂。温和碱性甲酯化生成脂肪酸甲酯，進行GC-MS分析。
2.4数据处理
研究结果为3次重复实验的平均值，采用Excel 2003和SPSS 17.0软件进行单因子方差分析（One-way ANOVA）（李志辉等，2003）。
3结果与讨论（Results and discussion）
3.1柴油对微生物活性的影响
本实验中原始的5种土样中藨草根际的微生物活性最高，高于其他土样0.1abs·（g.2h）-1以上。而土样之间微生物活性差别不大，无论是根际与非根际土，还是不同植物的根际土之间均无显著性差异（P<0.05），未表现出明显的根际效应。比较胁迫前后的土壤微生物活性可以看出，经过14d之后，土壤微生物的活性显著提高，其中芦苇根际土壤的微生物活性提高了约0.2abs·（g.2h）-1，达到了原始土样的2倍以上。表明研究区域的土壤微生物对柴油的短期胁迫具有一定的承受能力。比较14d后的5种土样中微生物活性可以发现，根际土壤中的微生物活性显著高于非根际土壤，不同根际土样之间也存在显著性差异（P<0.05）。说明湿地植物可以比较显著地改善受污染土壤的微生物活性，有利于提高油污沉积物的植物修复能力。许多其他的研究也显示植物根系能够增加受污染土壤中微生物的数量与活性（陈嫣等，2005；林学政等，2005；Liuetal.，2011）。在本实验的研究区域中，柴油胁迫后，芦苇根际土中微生物活性最高，可以将其作为生态修复的优势植物。
3.2柴油对土壤PLFA组成的影响
各种土壤样品中共鉴定出磷脂脂肪酸29种，碳链长度从12到24，包括饱和、不饱和及支链脂肪酸。其中11种PLFA（i14：0、14：0、i15：0、15：0、16：1ω7c、16：0、i17：0、17：0、18：0、i20：0、22：0）在5种原始土样中均被检测到，5种原始土样中分别检测到20、19、22、22和21种单体PLFA，并未表现出明显的差异，与微生物活性的分析结果一致。在各种PLFA中，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸占大多数，含量占总量的80%以上，其中12：0、16：0和16：1ω7c是主要的单体PLFA，根际土壤中单不饱和脂肪酸的比例显著高于非根际土壤（P<0.05）。5种受胁迫后的土样中共检测到22种单体PLFA。比较胁迫前后土壤中PLFA的组成可以发现，受到柴油胁迫后土壤中PLFA的种类明显减少，其中无植物土壤中仅检测到2种PLFA，而芦苇根际土壤受柴油影响较小，其中仍检测到18种单体PLFA。 分析PLFA的种类可以发现，受到胁迫前后土壤中PLFA组成也显著变化（P<0.05），不饱和脂肪酸的比例下降了20%，7种PLFA（i17：1ω5t、17：1ω7c、18：2ω6，9c、18：1ω7t、18：1ω10t、20：4w6，9，12，15c和20：5w3，6，9，12，15c）在胁迫前的土样中检测出，但在胁迫后的土样中未检测到，其中i17：1ω5t仅在茭白和芦苇根际土样中检测出，20：4w6，9，12，15c和20：5w3，6，9，12，15c仅在香附子根际土样中检测出。而在胁迫后的芦苇根际土壤中检测到2种原土中未检测到的PLFA（16：1ω5t和cy17：0）。16：1ω5t和cy17：0在胁迫后的其他土样中并未检测出，说明柴油的短期胁迫对根际土壤微生物群落的影响在不同植物间也具有显著的差异（P<0.05）。
比较生物多样性指数可知，柴油对土壤PLFA多样性产生显著影响，无植物土壤中PLFA多样性仅为胁迫前的1/3。不同根际土壤中PLFA多样性在胁迫之前存在显著性差异（P<0.05），受到柴油胁迫之后香附子和茭白根际土壤中PLFA多样性都大幅下降。而藨草和芦苇根际土样中的PLFA多样性略微上升，其中藨草和香附子、茭白根际土样中的PLFA多样性指数接近，说明柴油胁迫对土壤PLFA组成的影响强于大部分植物的根际效应。
3.3柴油对土壤微生物群落结构的影响
由于不同微生物体酶系不同，致使不同的生物体遗传有特定脂肪酸，因此特征脂肪酸是不同微生物类群的生物标志物，某些脂肪酸的比值是反映微生物群落结构特征的重要依据（Soderberg，2004）。
分析实验结果，各种特征脂肪酸的含量在不同原始土样中存在显著差异（P<0.05），根际土壤中特征脂肪酸的总量明显高于非根际土壤，其中藨草和香附子根际较其他植物含有更多的特征脂肪酸。比较不同的特征脂肪酸可以发现，原始土样中细菌和革兰氏阴性菌脂肪酸含量远高于真菌和革兰氏阳性菌。不同特征脂肪酸之间的比例在各种原始土样中变化并不大，说明间就区域不同土壤中的微生物结构比较接近。
比较柴油胁迫前后土样中特征脂肪酸的变化可以发现，除芦苇根际土壤外，受胁迫后的土壤中特征脂肪酸含量显著降低（P<0.05），其中无植物土壤中4类特征脂肪酸全部消失，这一结果与之前的分析结果一致。比较不同的特征脂肪酸可以发现，细菌和革兰氏阴性菌脂肪酸所占的比例进一步增加，说明研究区域土壤中对石油烃类物质具有降解作用的微生物主要是革兰氏阴性细菌，这与许多已有的研究结果相吻合（赵玉恒等，2006）。
比较受胁迫后的不同土样，可以发现不同土样中的特征脂肪酸含量存在显著性差异（P<0.05），与之前的实验结果相似的是，芦苇根际土壤PLFA含量在受到柴油的短期胁迫后出现了大量增加的现象。其中细菌脂肪酸的含量增加了3倍，革兰氏阳性菌脂肪酸甚至增加了近15倍，芦苇根际土壤中对柴油的降解可能主要由革兰氏阳性细菌贡献。不同土壤微生物群落在柴油胁迫下表现出不同的变化，其中芦苇根际微生物对柴油表现出很强的耐受能力，能够在高浓度柴油污染的土壤中大量生长，可以将其作为油污湿地环境修复的优势植物。
4结论（Conclusions）
本文研究了柴油短期胁迫对黄浦江-长江口沿岸湿地研究区土壤微生物群落的影响，研究证明柴油胁迫明显改变了土壤微生物群落结构：
（1）原始的5种土样中藨草根际的微生物活性最高，其他土样之间无显著性差异（P<0.05）。受到胁迫之后，土壤微生物的活性提高，其中芦苇根际土壤的微生物活性提高到了原土的2倍以上，根际土壤中的微生物活性均显著高于非根际土壤。说明根际微生物对柴油污染具有跟强的抵抗力，其中蘆苇根际土壤微生物对柴油的短期胁迫的承受能力最强。
（2）受到柴油胁迫后土壤中PLFA的种类明显减少，其中无植物土壤受到的影响最为明显，而芦苇根际土壤受柴油影响较小。受到胁迫前后土壤中PLFA组成也显著变化（P<0.05），不饱和脂肪酸的比例下降了20%，而且对不同植物的影响程度具有显著的差异（P<0.05）。
（3）土壤PLFA多样性指数分析显示，不同根际土壤中PLFA多样性在胁迫之前存在显著性差异（P<0.05），但在柴油胁迫之后藨草、香附子和茭白根际土样中的PLFA多样性接近，说明柴油胁迫对土壤PLFA组成的影响强于大部分植物的根际效应。
参考文献
[1]陈嫣，李广贺，张旭等.2005.石油污染土壤植物根际微生态环境与降解效应[J].清华大学学报（自然科学版），45（6）：784～787.
[2]李洪梅，郜玉环，江丽华等.2010.不同浓度石油烃对油菜产量、土壤中石油烃残留量及土壤微生物的影响[J].中国农学通报.26（17）：382～385.
[3]李慧，陈冠雄，杨涛等.2005.沈抚灌区含油污水灌溉对稻田土壤微生物种群及土壤酶活性的影响[J].应用生态学报.16（7）：1355～1359.
[4]林学政，沈继红，刘克斋等.2005.种植盐地碱蓬修复滨海盐渍土效果的研究.海洋科学进展.23（1）：65～69.
[5]李志辉，罗平.2003.统计分析教程（第二版）[M].北京：电子工业出版社.310～320.
[6]Wu Y P，Xu J M，Wang H Z. 2006.Application of Sherlock MIS in identification of soil bacteria. Acta Pedologica Sinica，43（4）：642～647.
[7]Zelles L，Bai Q Y.1993.Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS.Soil Biol.Biochem，25：495～507.