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【摘 要】 目的：建立祛风安脑口服液定性、定量分析方法。 方法：采用TLC对麻黄、黄芩、防风、川芎进行定性鉴别；采用HPLC测定阿魏酸含量，色谱条件：以Inertsil ODS-3（250mm×4.6nm，5μm）为色谱柱，甲醇-1%冰醋酸（30∶70）为流动相，检测波长为321nm，柱温为25℃。结果：薄层色谱斑点清晰，阴性对照无干扰；阿魏酸在1.824～10.940μg线性关系良好（r=0.9998），平均回收率为100.51%，RSD=1.94%。结论：本方法简便易行、结果准确，可作为该产品质量控制的方法。
【关键词】 祛风安脑口服液；阿魏酸；HPLC ；TLC
【中图分类号】R286 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）06-0019-04
祛风安脑口服液是我院中药制剂，处方源于《备急千金要方》所载的续命汤，由麻黄、红参、黄芩、肉桂、甘草、川芎、苦杏仁、熟附子、防风、干姜、石膏、赤芍、当归这十三味药材加工制成，具有疏通经络、调和营卫、解表祛邪的功效，临床用于中风、身体不能自持、口不能言或拘急不得转侧等症。为保证制剂质量稳定可控，研究采用薄层色谱法（TLC）对该制剂主要成分麻黄、防风、川芎、黄芩进行薄层色谱鉴别，并参考相关文献[1-2]，采用高效液相色谱法（HPLC）测定制剂中阿魏酸的含量，为制定祛风安脑口服液的质量标准提供依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 SIL-10AF高效液相（含SPD-15C紫外检测器，岛津国际贸易上海有限公司）；XS205DU十万分之一天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；R-1001N旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；
1.2 材料 硅胶板（青岛海洋化工分厂）；点样毛细管（泰州市北平贸易有限公司）；黄芩苷对照品（批号110715-200212，中国药品生物制品鉴定所）；阿魏酸对照品（批号110773-201313，中国食品药品检定研究院）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 祛风安脑口服液的制备 除肉桂、红参外，其他药材加10倍量水，加热煎煮两次，每次1.5h，合并2次煎液，滤过。滤液浓缩，加入乙醇至乙醇浓度为65%，静置24h，滤过，回收乙醇至无醇味。取红参，加10倍水，加热煎煮2次，每次1.5h，滤过，合并2次煎液，浓缩，与上述制得的浓缩液合并，再加入肉桂粉，煮10min，过滤，加入苯甲酸3g，加蒸馏水至900ml，静置24h，滤过，滤液调至总量为1000ml，灌装，即得。
2.2 TLC定性鉴定
2.2.1 麻黄TLC 取样品20ml，加氨水调pH至1～2，用乙醚萃取2次，合并乙醚层，挥干乙醚，加盐酸乙醇（1∶20）10ml，摇匀，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，即为供试品溶液。另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成浓度为1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液各5ml，分别点于硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水=8∶2∶1为展开剂[3]，展开，晾干，喷以茚三酮试液，105℃烘5min。供试品在与对照品的相应色谱位置上，均显相同紫红色斑点，Rf=0.62。
2.2.2 川芎TLC 取制剂样品10ml，加乙醚20ml萃取，超声10min，过滤，挥干乙醚，加乙酸乙酯1ml，即为供试品溶液。另取相同制备工艺制成的缺川芎的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。取川芎对照药材1g，加乙醚20ml，超声10min，滤过，挥干，加乙酸乙酯1ml，制成对照液。吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G板，以氯仿-甲醇=8∶1为展开剂[4]，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰，Rf=0.857。
2.2.3 防风TLC 取制剂样品15ml，用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取相同制备工艺制成的缺防风的阴性样品，同法制成阴性对照液，取防风对照药材1g，加甲醇10ml，回流30min，滤过，滤液蒸干，加水20ml使溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次15ml，合并乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解作为对照药材溶液。吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇=4∶1为展开剂[5]，展开，取出，晾干。置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰，Rf=0.758。
2.2.4 黄芩TLC 取制剂样品10ml，用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，水浴蒸干，加甲醇溶解，作为供试液。另取相同制备工艺制成的缺黄芩的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成浓度为1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液各5μl，分别点于硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水=7∶2∶0.5∶0.5为展开剂[6]，展开，取出，晾干。喷三氯化铁的乙醇溶液，晾干，供試品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同墨绿色的斑点，阴性对照无干扰，Rf=0.756。
2.3 HPLC含量测定
2.3.1 色谱条件 色谱柱：InertsilODS-3（250mm×4.6nm，5μm）；流动相：甲醇-1%冰醋酸（30∶70）；检测波长：321nm；柱温：25℃；流速：1ml/min；进样量：10μl。在上述色谱条件下，按阿魏酸峰计算，理论塔板数在4000以上[5]；祛风安脑口服液中阿魏酸的色谱峰与其他成分的色谱峰分离良好，且阴性样品溶液无干扰。见图1。
2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸4.56mg定容于25ml棕色容量瓶中，加甲醇配成182.40μg/ml对照品储备液，精密量取1ml对照品储备液，定容于10ml的棕色容量瓶中，制成含70%甲醇，浓度为18.24μg/ml的对照品溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。 2.3.3 供試品溶液的制备 精密称取祛风安脑口服液10ml，用乙醚10ml萃取，萃取3次，挥干乙醚，用甲醇定容于100ml的容量瓶，制成供试品液，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3.4 阴性对照品溶液的制备 按处方量制成缺当归及川芎的阴性样品，同供试品溶液的制备制成阴性对照液。
2.3.5 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液（18.24μg/ml）1、2、3、4、5、6ml置于10ml的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。按上述色谱条件，测定峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），以进样量（μg）为横坐标（X），绘制标准曲线，计算得回归方程Y=58526X+11512，r=0.9998。结果表明：阿魏酸在1.824～10.940μg范围内呈良好的线性关系。
2.3.6 精密度试验 吸取对照品溶液10μl，在所选色谱条件下连续进样5次，测定阿魏酸峰面积值，RSD=1.11%。结果表明，仪器的精密度良好。
2.3.7 重复性试验 精密量取同一批样品5份，按供试品溶液制备方法项下方法操作，共配制5份供试液，各进样10μl，结果测定出的含量RSD为1.67%，表明实验重复性良好。
2.3.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10h进样，测定阿魏酸色谱峰面积，比较10h内测得制剂含量RSD值。实验结果显示，RSD为2.00%，表明本供试品溶液在室温下放置10h内稳定。
2.3.9 加样回收率试验 采用加样回收法，取已知含量同一样品，分别加标0.8倍、1.0倍、1.2倍，每个水平重复3次。按上述的色谱条件进样，计算回收率，结果见表1。
2.3.10 样品测定 精密量取5批祛风安脑口服液，并按“2.3.3”项下制成供试品溶液，分别取10μl，注入高效液相色谱仪，在上述的色谱条件下记录峰面积，计算阿魏酸的含量。结果见表2。3 讨论
祛风安脑口服液为中药复方制剂，当归和川芎中的共有成分阿魏酸为有效成分之一，故实验选择阿魏酸的含量作为祛风安脑口服液质量控制的参考依据。
由于本品为中药复方制剂，成分复杂，故采用水提后，65%乙醇醇沉，除去水提液中的淀粉、树胶、多糖、粘液质色素等，而乙醇的上清液含有鞣质、生物碱、苷类等[7]。测定阿魏酸含量时，先用乙醚萃取3次，以减少其他成分干扰。报道阿魏酸对光和热不稳定[8]，因此稀释后应置于棕色瓶中，于冰箱中保存。
实验结果表明，通过薄层色谱的定性鉴别，各检出成分不受处方中其他成分的干扰，方法简便、快速、专属性强、重复性好。通过阿魏酸的含量测定，可知祛风安脑口服液中阿魏酸在1.824～10.940g/ml范围内线性良好，方法的精密度实验、重复性试验均在合理的范围内，且本供试品溶液在10h内稳定，可见运用本方法测定祛风安脑口服液中阿魏酸的含量可行。
参考文献
[1] 顾民，张亮，张正行.HPLC测定逍遥散及当归中阿魏酸的含量[J].中成药，2000 ，22（5）：32.
[2] 王卫锋，康阿龙，汤迎爽，等.HPLC测定妇月康胶囊中阿魏酸的含量[J].中成药，2004 ，26（6）：8.
[3] 胡英，刘庆荣.感冒软胶囊中盐酸麻黄碱的薄层色谱鉴别方法探讨[J].中国药事，2006，20（9）：573.
[4] 孙菲，丁莹，梁雪，等.川芎、当归的薄层鉴别[J].中国医药学报，2013，41（2）：56-57.
[5] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部） [S]. 北京：中国医药科技出版社，2010.
[6] 陈菲菲.黄芩苷的提取及结构鉴定[J].天然药物化学实验开题报告，
[7] 王庆.浅谈中药的醇沉工艺及设备[J].中国制药装备，2009，11（11）：38.
[8] 孙忠，彭康.HPLC法测定安阳还五汤中阿魏酸的含量研究[J].中医药学刊，2004，22（5） ：833.
（收稿日期：2016.01.04）
【关键词】 祛风安脑口服液；阿魏酸；HPLC ；TLC
【中图分类号】R286 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）06-0019-04
祛风安脑口服液是我院中药制剂，处方源于《备急千金要方》所载的续命汤，由麻黄、红参、黄芩、肉桂、甘草、川芎、苦杏仁、熟附子、防风、干姜、石膏、赤芍、当归这十三味药材加工制成，具有疏通经络、调和营卫、解表祛邪的功效，临床用于中风、身体不能自持、口不能言或拘急不得转侧等症。为保证制剂质量稳定可控，研究采用薄层色谱法（TLC）对该制剂主要成分麻黄、防风、川芎、黄芩进行薄层色谱鉴别，并参考相关文献[1-2]，采用高效液相色谱法（HPLC）测定制剂中阿魏酸的含量，为制定祛风安脑口服液的质量标准提供依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 SIL-10AF高效液相（含SPD-15C紫外检测器，岛津国际贸易上海有限公司）；XS205DU十万分之一天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；R-1001N旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；
1.2 材料 硅胶板（青岛海洋化工分厂）；点样毛细管（泰州市北平贸易有限公司）；黄芩苷对照品（批号110715-200212，中国药品生物制品鉴定所）；阿魏酸对照品（批号110773-201313，中国食品药品检定研究院）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 祛风安脑口服液的制备 除肉桂、红参外，其他药材加10倍量水，加热煎煮两次，每次1.5h，合并2次煎液，滤过。滤液浓缩，加入乙醇至乙醇浓度为65%，静置24h，滤过，回收乙醇至无醇味。取红参，加10倍水，加热煎煮2次，每次1.5h，滤过，合并2次煎液，浓缩，与上述制得的浓缩液合并，再加入肉桂粉，煮10min，过滤，加入苯甲酸3g，加蒸馏水至900ml，静置24h，滤过，滤液调至总量为1000ml，灌装，即得。
2.2 TLC定性鉴定
2.2.1 麻黄TLC 取样品20ml，加氨水调pH至1～2，用乙醚萃取2次，合并乙醚层，挥干乙醚，加盐酸乙醇（1∶20）10ml，摇匀，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，即为供试品溶液。另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成浓度为1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液各5ml，分别点于硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水=8∶2∶1为展开剂[3]，展开，晾干，喷以茚三酮试液，105℃烘5min。供试品在与对照品的相应色谱位置上，均显相同紫红色斑点，Rf=0.62。
2.2.2 川芎TLC 取制剂样品10ml，加乙醚20ml萃取，超声10min，过滤，挥干乙醚，加乙酸乙酯1ml，即为供试品溶液。另取相同制备工艺制成的缺川芎的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。取川芎对照药材1g，加乙醚20ml，超声10min，滤过，挥干，加乙酸乙酯1ml，制成对照液。吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G板，以氯仿-甲醇=8∶1为展开剂[4]，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰，Rf=0.857。
2.2.3 防风TLC 取制剂样品15ml，用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取相同制备工艺制成的缺防风的阴性样品，同法制成阴性对照液，取防风对照药材1g，加甲醇10ml，回流30min，滤过，滤液蒸干，加水20ml使溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次15ml，合并乙酸乙酯层，水浴蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解作为对照药材溶液。吸取上述溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇=4∶1为展开剂[5]，展开，取出，晾干。置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰，Rf=0.758。
2.2.4 黄芩TLC 取制剂样品10ml，用乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，水浴蒸干，加甲醇溶解，作为供试液。另取相同制备工艺制成的缺黄芩的阴性样品，同法制成阴性对照品溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成浓度为1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。吸取上述溶液各5μl，分别点于硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水=7∶2∶0.5∶0.5为展开剂[6]，展开，取出，晾干。喷三氯化铁的乙醇溶液，晾干，供試品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同墨绿色的斑点，阴性对照无干扰，Rf=0.756。
2.3 HPLC含量测定
2.3.1 色谱条件 色谱柱：InertsilODS-3（250mm×4.6nm，5μm）；流动相：甲醇-1%冰醋酸（30∶70）；检测波长：321nm；柱温：25℃；流速：1ml/min；进样量：10μl。在上述色谱条件下，按阿魏酸峰计算，理论塔板数在4000以上[5]；祛风安脑口服液中阿魏酸的色谱峰与其他成分的色谱峰分离良好，且阴性样品溶液无干扰。见图1。
2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸4.56mg定容于25ml棕色容量瓶中，加甲醇配成182.40μg/ml对照品储备液，精密量取1ml对照品储备液，定容于10ml的棕色容量瓶中，制成含70%甲醇，浓度为18.24μg/ml的对照品溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。 2.3.3 供試品溶液的制备 精密称取祛风安脑口服液10ml，用乙醚10ml萃取，萃取3次，挥干乙醚，用甲醇定容于100ml的容量瓶，制成供试品液，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3.4 阴性对照品溶液的制备 按处方量制成缺当归及川芎的阴性样品，同供试品溶液的制备制成阴性对照液。
2.3.5 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液（18.24μg/ml）1、2、3、4、5、6ml置于10ml的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。按上述色谱条件，测定峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），以进样量（μg）为横坐标（X），绘制标准曲线，计算得回归方程Y=58526X+11512，r=0.9998。结果表明：阿魏酸在1.824～10.940μg范围内呈良好的线性关系。
2.3.6 精密度试验 吸取对照品溶液10μl，在所选色谱条件下连续进样5次，测定阿魏酸峰面积值，RSD=1.11%。结果表明，仪器的精密度良好。
2.3.7 重复性试验 精密量取同一批样品5份，按供试品溶液制备方法项下方法操作，共配制5份供试液，各进样10μl，结果测定出的含量RSD为1.67%，表明实验重复性良好。
2.3.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10h进样，测定阿魏酸色谱峰面积，比较10h内测得制剂含量RSD值。实验结果显示，RSD为2.00%，表明本供试品溶液在室温下放置10h内稳定。
2.3.9 加样回收率试验 采用加样回收法，取已知含量同一样品，分别加标0.8倍、1.0倍、1.2倍，每个水平重复3次。按上述的色谱条件进样，计算回收率，结果见表1。
2.3.10 样品测定 精密量取5批祛风安脑口服液，并按“2.3.3”项下制成供试品溶液，分别取10μl，注入高效液相色谱仪，在上述的色谱条件下记录峰面积，计算阿魏酸的含量。结果见表2。3 讨论
祛风安脑口服液为中药复方制剂，当归和川芎中的共有成分阿魏酸为有效成分之一，故实验选择阿魏酸的含量作为祛风安脑口服液质量控制的参考依据。
由于本品为中药复方制剂，成分复杂，故采用水提后，65%乙醇醇沉，除去水提液中的淀粉、树胶、多糖、粘液质色素等，而乙醇的上清液含有鞣质、生物碱、苷类等[7]。测定阿魏酸含量时，先用乙醚萃取3次，以减少其他成分干扰。报道阿魏酸对光和热不稳定[8]，因此稀释后应置于棕色瓶中，于冰箱中保存。
实验结果表明，通过薄层色谱的定性鉴别，各检出成分不受处方中其他成分的干扰，方法简便、快速、专属性强、重复性好。通过阿魏酸的含量测定，可知祛风安脑口服液中阿魏酸在1.824～10.940g/ml范围内线性良好，方法的精密度实验、重复性试验均在合理的范围内，且本供试品溶液在10h内稳定，可见运用本方法测定祛风安脑口服液中阿魏酸的含量可行。
参考文献
[1] 顾民，张亮，张正行.HPLC测定逍遥散及当归中阿魏酸的含量[J].中成药，2000 ，22（5）：32.
[2] 王卫锋，康阿龙，汤迎爽，等.HPLC测定妇月康胶囊中阿魏酸的含量[J].中成药，2004 ，26（6）：8.
[3] 胡英，刘庆荣.感冒软胶囊中盐酸麻黄碱的薄层色谱鉴别方法探讨[J].中国药事，2006，20（9）：573.
[4] 孙菲，丁莹，梁雪，等.川芎、当归的薄层鉴别[J].中国医药学报，2013，41（2）：56-57.
[5] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（一部） [S]. 北京：中国医药科技出版社，2010.
[6] 陈菲菲.黄芩苷的提取及结构鉴定[J].天然药物化学实验开题报告，
[7] 王庆.浅谈中药的醇沉工艺及设备[J].中国制药装备，2009，11（11）：38.
[8] 孙忠，彭康.HPLC法测定安阳还五汤中阿魏酸的含量研究[J].中医药学刊，2004，22（5） ：833.
（收稿日期：2016.01.04）