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摘要 目的：探讨长期高脂饲养ApoE-/-小鼠中医的证型，为抗动脉粥样硬化证候中药的研究提供证型动物模型。方法：将20只雄性ApoE-/-小鼠按随机数字表法分为四妙勇安汤组（SM组）和模型组（M组），每组10只，采用高脂饲料喂养14周建立动脉粥样硬化模型，SM组于造模开始进行预防性给药。同时以C57BL/6小鼠10只作为正常对照组（N组）。检测血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，观察主动脉和肝脏病理，评价是否为血瘀痰湿证型;通过IL-6、核因子-κB免疫组织化学变化评价是否为毒损证型。结果：与N组比较，M组小鼠血清TC、TG、LDL-C显著提高，HDL-C显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;肝脏病理出现球形脂滴及炎性细胞浸润;主动脉出现明显斑块，血管内膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）、斑块面积（PA）及IT/MT明显增大，差异有统計学意义（P<0.05），血管管腔面积（LA）明显减小，差异有统计学意义（P<0.05）;免疫组织化学显示IL-6、核因子-κB在主动脉的表达明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，SM组能够明显降低ApoE-/-小鼠主动脉PA、IT及IT/MT，明显降低IL-6及核因子-κB表达，差异有统计学意义（P<0.05）;减轻肝脏病变;但对血脂水平无明显作用。结论：长期高脂饲料饲养ApoE-/-小鼠制备的动脉粥样硬化模型为痰湿血瘀毒损型病证结合动物模型。
关键词 动脉粥样硬化;ApoE-/-小鼠;病证结合动物模型;痰湿血瘀毒损;四妙勇安汤
Preliminary Study on TCM Syndromes of ApoE-/-Mouse Atherosclerosis Model
BAI Yunqi1，LI Hui2，SONG Ke1，WANG Shuqi2，GAO Zhao1，SUN Kehan2，JIN Qiushuo1，LOU Lixia1，WU Aiming1，WU Shengxian1，NIE Bo1，2
（1 Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2 School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）
Abstract Objective：To explore the long-term high-fat feeding of ApoE-/-mice with TCM syndrome types，and provide animal models for the research of anti-atherosclerosis syndromes in traditional Chinese medicine.Methods：A total of 20 male ApoE-/-mice were divided into Simiao Yongan Decoction group （SM group） and model group （M group） according to the random number table method.10 mice in each group were fed with high-fat diet for 14 weeks to establish atherosclerosis model.Meanwhile，the SM group started preventive administration at the time of modeling.At the same time，10 mice of C57BL / 6 were used as the normal control group （group N）.By measuring serum total cholesterol （TC），triglyceride （TG），high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C），and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C） levels，observing aorta and liver pathology to evaluate whether it was the blood stasis phlegm-dampness syndrome type; evaluating whether it was a poisonous syndrome type by the changes of IL-6 and NF-κB immunohistochemical.Results：Compared with the control group，the serum levels of TC，TG，and LDL-C in the model group were significantly increased （P<0.01），HDL-C was significantly reduced （P<0.01）; spherical lipid droplets and inflammatory cell infiltration appeared in the liver pathology; obvious plaques appeared in the aorta; aortic intima thickness （IT），media thickness （MT），plaque area （PA），and IT / MT significantly increased （P<0.01），and the vascular lumen area （LA） decreased significantly （P<0.01）; immunohistochemistry showed that the expression of IL-6 and NF-κB in the aorta was significantly increased （P<0.05）.com pared with the model group，the SM group can significantly reduce the aorta PA，IT and IT / MT of ApoE-/-mice （P<0.05），and significantly reduce the expression of IL-6 and NF-κB （P<0.05）; it also reduced liver disease but had no significant effect on blood lipid levels.Conclusion：The atherosclerosis model prepared by the classic long-term high-fat feed ApoE-/-mice was preliminary evaluated as an animal model of phlegm dampness and blood stasis and toxin damage.
Keywords Atherosclerosis; ApoE-/-mice; Disease combined syndrome animal model; Phlegm dampness blood stasis toxin damage; Simiao Yongan Decoction
中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.011
心脑血管疾病发展的主要病理基础是动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）。AS属于中医的“脉痹”“胸痹”“眩晕”“中风”等病证，既往医家将AS概括为“虚”“瘀”“痰”“毒”四证[1-3]，并将AS辨证分型暂分为气滞血瘀证、痰瘀互结证、气虚血瘀证、气阴两虚证4种[3]。痰湿、血瘀、毒损始终贯穿动脉粥样硬化整个病程[4-6]。研究痰湿血瘀毒损型AS模型对于AS的中医治疗具有重要意义。长期高脂饲料饲养喂养ApoE-/-小鼠是建立AS动物模型的经典方法，已经被广泛研究并应用于AS的发病机制、药物防治等方面[7]，但尚未见有关该经典模型的中医证型研究报道。因此，本研究以长期高脂饲料饲养ApoE-/-小鼠制备AS模型为研究对象，根据长期饲养高脂饮食造模的特点，建立主要证候量表，选择与痰湿、血瘀、毒损密切相关的客观指标，并运用有效方剂四妙勇安汤进行反证，评价ApoE-/-小鼠AS经典模型的中医证型——痰湿血瘀毒损证，为抗AS证候类中药的研究提供痰湿血瘀毒损证候动物模型。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
C57BL/6小鼠10只，ApoE-/-小鼠20只，雄性，SPF级体质量18～22 g，7周龄，采购于维通利华公司，动物合格证编号：SCXK（京）2012-0001，本研究得到北京中医药大学东直门医院动物伦理委员会的批准，并在此批准下进行（批号：18-17）。高脂饲料（配方：15%脂肪+0.25%胆固醇+84.75%基础饲料，许可证号：SCXK（京）2014-0008）;基础饲料（北京科奥协力饲料有限公司）饲料均经60Coγ照射灭菌处理。
1.1.2 药物
四妙勇安汤组方：玄参（批号：150181431）、当归（批号：150313061）、甘草（批号：150280731）、金银花（批号：15051904），药品购买于东直门医院药房，然后在实验室水煎浓缩制取，分装4 ℃保存。
1.1.3 试剂与仪器 苏木精染色液、伊红溶液（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLT-9610，ZLT-9613）;IL-6、核因子-κB抗体（Abcam公司，美国，ab8227，ab208113）;三步法免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，SP-9000）;DAB显色试剂盒（北京Solarbio有限公司，20170628）。光学显微镜（OLYMPUS公司，日本，OLYMPUS BX60）;体视镜（上海勤奋仪器厂，XTT型000037）;低温多用途离心机（eppendorf公司，德国，Centrifuge 5424R）;全自动生化测定仪（BECKMAN COULTER公司，美国，AU5800）;组织切片机（Arcadia公司，德国，RM2135）;组织包埋机（Arcadia公司，德国，EG1150）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备
所有动物饲养条件：室温保持22～24 ℃，12 h交替照明，相对湿度50%，饮水不限，自由摄食。适应性喂养1周后，10只C57BL/6J为正常对照组（N组），将20只ApoE-/-小鼠随机分为模型组（M组）、四妙勇安汤组（SM组），每组10只。
1.2.2 干预方法
M、SM组均给予高脂饲料进行喂养，同时SM组以四妙勇安汤浓缩液34.9 g/kg灌胃[8]，N组和M组给予等量生理盐水灌胃，均1次/d，连续灌胃14周。
1.2.3 检测指标与方法
1）一般状况：对各组小鼠每14天测1次体质量、进食量。观察各组小鼠的饮水量、毛发、精神活动、大小便、皮肤瘀点瘀斑等一般情况。
2）血脂测定：灌胃14周后进行取材，取材前夜禁食但不禁水，采取摘除眼球取血方式，以4 ℃、2 500×g的条件下离心20 min，分离血清，然后取上清液;最后使用全自动生化分析仪检测血清的三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）指标。
3）病理学检测：摘眼球取血后，取小鼠肝脏及主动脉根部，并放置于4%多聚甲醛中固定24 h，脱水后进行石蜡包埋，制片的厚度为3 μm，连续切片，进行HE染色。在光镜下观察小鼠主动脉、肝脏病理形态，并在100倍光镜下，随机选择3个视野进行采集图像。用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件对主动脉HE染色片子进行图像分析，并测量血管内膜厚度（IT）、血管管腔面积（LA）、斑块面积（PA）、中膜厚度（MT）及IT/MT，取其平均值进行统计学分析。见图1。4）主动脉免疫组织化学检测：制片方法同HE染色，按照试剂盒说明书对样本进行染色、观察及评分。镜下染色无色为阴性，计0分;呈淡黄色为弱阳性，计1分;呈棕黄色则为阳性，计2分;呈黄褐色视作强阳性细胞，计3分。每张切片选取相同位置的5个视野打分[9]。 1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件分析数据，实验数据进行正态分布及方差齐性统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析比较多组之间数据平均数，采用LSD法进行组间两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
高脂饲养2周后，与N组比较，M组出现小鼠皮毛不整、无光泽，饮食量增多，其余症状未见明显异常。4周后，SM组小鼠皮毛光泽度较M组稍有改善，其余症状未见明显异常。小鼠体质量变化情况见表1。
2.2 各组小鼠血脂比较
与N组比较，模型组小鼠TC、HDL-C、LDL-C均明显高于N组，差异有统计学意义（P<0.05）;与M组比较，SM组TC、HDL-C、LDL-C均明显高于M组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 肝脏、主动脉病理学观察
主动脉HE染色显示，N组小鼠主动脉内皮细胞及平滑肌细胞排列整齐规则，内膜完整，未见斑块。與N组比较，M组小鼠主动脉根部形成明显AS斑块，内皮细胞排列紊乱，内膜明显增厚，中膜平滑肌排列紊乱且萎缩变薄，IT、PA、IT/MT、PA/LA明显增大，LA明显减小，差异有统计学意义（P<0.05）;与M组比较，SM组均有所改善。各组小鼠的主动脉组织病理结果见图2～3。
肝脏HE染色显示：N组小鼠的肝小叶结构清晰完整，肝细胞索排列整齐呈放射状，无脂肪变性细胞，无炎性反应和坏死的细胞。与N组小鼠比较，M组小鼠的肝小叶界限不清晰，出现球形脂滴，炎性反应细胞浸润;与M组比较，SM组肝组织病理形态改善，炎性细胞浸润和球形脂滴相对减少。各组小鼠肝组织病理观察结果见图4。
2.4 小鼠主动脉组织IL-6、NF-κB表达情况
免疫组织化学染色结果显示：主动脉核因-κB阳性表达主要位于内膜内皮细胞及中膜平滑肌的细胞核中，同时胞质中也少量分布，可见棕色染色颗粒;IL-6阳性表达主要位于内膜内皮细胞及中膜平滑肌的胞质中，可见棕色染色颗粒。N组未见棕染颗粒或少量棕染颗粒。M组可见大量胞核、胞质被棕染，较正常组阳性表达多，差异有统计学意义（P<0.05）;与M组比较，SM组细胞核、细胞质染色明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5～6，表3。
3 讨论
AS是导致急性心血管病事件发病的主要病因，《中国心血管病报告2018》发布人类死亡的首要因素是急性心脑血管疾病，约占总死亡率的70%[10]。目前，防治AS多采用调控血脂、稳定斑块等方法或采用动脉内膜剥脱术等手段进行治疗[11]。因AS发病原因多样，病理过程复杂，因此临床上常规治疗手段及西医药物均不能有效防控AS的发生[12]。中医基础理论及思维方法在防控AS方面具有独特优势，临床和实验研究中有近百种中药复方对防治AS有积极作用[13]。辨证论治是中医学的基本原则之一，是中医治疗疾病的特色，是个体化治疗的基础，所以在研究AS中医防治时，中医证型的诊断就尤为重要。动物模型有助于进行高效、经济的发病机制研究。AS动物模型是研究AS疾病的主要方法之一[14]，因此研究与临床证型相关的动物模型的病证结合动物模型就十分重要。
目前，国内外研究AS的动物模型种类较多。采用高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠制备AS的造模方法认可度高，被广泛应用到AS的发病机制、中医药防治等各领域[15-17]，但尚未见对该动物模型开展证型分析研究。因此，本研究采用ApoE-/-小鼠并给予高脂饮食14周，建立AS疾病模型，评价该模型的中医证型。小鼠平素食肥甘厚味，伤及脾胃，脾失健运，而致气机不畅。气为血之帅，血为气之母，气血失调是痰瘀互结形成之本，气虚而至无力行血，血瘀内停。《金匮要略心典》言：“毒，邪气蕴结不解之谓”。血瘀内停日久、脏腑功能失调，气血运行紊乱，则至毒邪内生。瘀血日久内生成毒。因此，本研究从理论上推断该模型是血瘀痰湿毒损证模型。
研究发现，血瘀证可以出现全身或局部组织器官的缺血、缺氧、血循环障碍以及血液流变性和黏滞性异常而导致各组织器官血栓形成、组织变性、结缔组织增生等一系列的病理变化[18-19]。本研究选择常见血栓多发部位的主动脉进行病理检测，M组出现明显斑块，内膜可见大量泡沫细胞和胆固醇结晶沉积，血瘀症状明显。毒邪在现代医学中可以看成毒性氧自由基、炎性反应递质和血管活性物质的过度释放[20-22]。本研究选择机体处于炎性反应，作为判定毒邪内生的临床标准，并对炎性反应递质IL-6、核因子-κB进行检测，N组未见棕染颗粒，M组可见大量胞核、胞质被棕染，较正常组阳性表达多。痰湿证被广泛认可为高脂血症[23]，并常见于肝脏病理、血脂和肝功能指标异常，OGTT和ITT异常[24]。本研究选择肝脏病理和血脂指标作为评价是否为痰湿证的标准，N组小鼠肝脏病理和血脂正常。M组小鼠肝小叶界限不清晰，出现球形脂滴，炎性细胞浸润，血脂明显增高。从实验药理学研究结果显示，该模型符合血瘀痰湿毒损证模型。
SM具有抗炎、降脂、免疫调节等作用[25]，已有研究表明，SM可以降低AS家兔血清中基质金属蛋白酶-9（MMP-9），C反应蛋白（CRP）水平，减少AS斑块内脂质含量和巨噬细胞数量，且在炎性反应递质的刺激下，可抑制内皮细胞白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的分泌，从而均起到抑制炎性反应、降脂的作用[26]，发挥降低血脂、保护内皮功能，稳定斑块等作用。本研究使用SM对痰湿血瘀毒损证候动物模型进行药物反证，小鼠一般客观指标得到改善，主动脉斑块减少、主动脉IL-6、核因子-κB表达降低，肝脏球形脂滴及炎性细胞浸润相对减少，说明中医药对AS有改善作用。 綜上所述，本实验对长期高脂饲料饲养ApoE-/-小鼠制备的AS模型进行了证型评价，为痰湿血瘀毒损型进一步验证SM具有抑制炎性反应，减轻AS程度的作用，为防治AS中医药研究提供病证动物模型。然而，目前捕捉到该模型的痰湿血瘀毒损表征有限，下一步更深入研究可加入血流动力学检测、肝脏超声等现代技术手段以及更严谨、具体的动物行为学观察量表，以期达到更好的效果。
参考文献
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（2020-02-13收稿 责任编辑：杨觉雄）
基金项目：国家科技重大专项（2017ZX09304019）;国家自然科学基金青年基金项目（81403365）;国家自然科学基金面上项目（81874446）
作者简介：白云绮（1994.08—），女，硕士研究生，医师，研究方向：中西医结合防治动脉粥样硬化，E-mail：1723668165@qq.com
通信作者：聂波（1977.12—），女，博士，研究员，研究方向：中医药防治动脉粥样硬化及其作用机制，中药药效物质质量标准及药物代谢，E-mail：nieboww_1977@163.com
关键词 动脉粥样硬化;ApoE-/-小鼠;病证结合动物模型;痰湿血瘀毒损;四妙勇安汤
Preliminary Study on TCM Syndromes of ApoE-/-Mouse Atherosclerosis Model
BAI Yunqi1，LI Hui2，SONG Ke1，WANG Shuqi2，GAO Zhao1，SUN Kehan2，JIN Qiushuo1，LOU Lixia1，WU Aiming1，WU Shengxian1，NIE Bo1，2
（1 Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2 School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）
Abstract Objective：To explore the long-term high-fat feeding of ApoE-/-mice with TCM syndrome types，and provide animal models for the research of anti-atherosclerosis syndromes in traditional Chinese medicine.Methods：A total of 20 male ApoE-/-mice were divided into Simiao Yongan Decoction group （SM group） and model group （M group） according to the random number table method.10 mice in each group were fed with high-fat diet for 14 weeks to establish atherosclerosis model.Meanwhile，the SM group started preventive administration at the time of modeling.At the same time，10 mice of C57BL / 6 were used as the normal control group （group N）.By measuring serum total cholesterol （TC），triglyceride （TG），high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C），and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C） levels，observing aorta and liver pathology to evaluate whether it was the blood stasis phlegm-dampness syndrome type; evaluating whether it was a poisonous syndrome type by the changes of IL-6 and NF-κB immunohistochemical.Results：Compared with the control group，the serum levels of TC，TG，and LDL-C in the model group were significantly increased （P<0.01），HDL-C was significantly reduced （P<0.01）; spherical lipid droplets and inflammatory cell infiltration appeared in the liver pathology; obvious plaques appeared in the aorta; aortic intima thickness （IT），media thickness （MT），plaque area （PA），and IT / MT significantly increased （P<0.01），and the vascular lumen area （LA） decreased significantly （P<0.01）; immunohistochemistry showed that the expression of IL-6 and NF-κB in the aorta was significantly increased （P<0.05）.com pared with the model group，the SM group can significantly reduce the aorta PA，IT and IT / MT of ApoE-/-mice （P<0.05），and significantly reduce the expression of IL-6 and NF-κB （P<0.05）; it also reduced liver disease but had no significant effect on blood lipid levels.Conclusion：The atherosclerosis model prepared by the classic long-term high-fat feed ApoE-/-mice was preliminary evaluated as an animal model of phlegm dampness and blood stasis and toxin damage.
Keywords Atherosclerosis; ApoE-/-mice; Disease combined syndrome animal model; Phlegm dampness blood stasis toxin damage; Simiao Yongan Decoction
中圖分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.011
心脑血管疾病发展的主要病理基础是动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）。AS属于中医的“脉痹”“胸痹”“眩晕”“中风”等病证，既往医家将AS概括为“虚”“瘀”“痰”“毒”四证[1-3]，并将AS辨证分型暂分为气滞血瘀证、痰瘀互结证、气虚血瘀证、气阴两虚证4种[3]。痰湿、血瘀、毒损始终贯穿动脉粥样硬化整个病程[4-6]。研究痰湿血瘀毒损型AS模型对于AS的中医治疗具有重要意义。长期高脂饲料饲养喂养ApoE-/-小鼠是建立AS动物模型的经典方法，已经被广泛研究并应用于AS的发病机制、药物防治等方面[7]，但尚未见有关该经典模型的中医证型研究报道。因此，本研究以长期高脂饲料饲养ApoE-/-小鼠制备AS模型为研究对象，根据长期饲养高脂饮食造模的特点，建立主要证候量表，选择与痰湿、血瘀、毒损密切相关的客观指标，并运用有效方剂四妙勇安汤进行反证，评价ApoE-/-小鼠AS经典模型的中医证型——痰湿血瘀毒损证，为抗AS证候类中药的研究提供痰湿血瘀毒损证候动物模型。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
C57BL/6小鼠10只，ApoE-/-小鼠20只，雄性，SPF级体质量18～22 g，7周龄，采购于维通利华公司，动物合格证编号：SCXK（京）2012-0001，本研究得到北京中医药大学东直门医院动物伦理委员会的批准，并在此批准下进行（批号：18-17）。高脂饲料（配方：15%脂肪+0.25%胆固醇+84.75%基础饲料，许可证号：SCXK（京）2014-0008）;基础饲料（北京科奥协力饲料有限公司）饲料均经60Coγ照射灭菌处理。
1.1.2 药物
四妙勇安汤组方：玄参（批号：150181431）、当归（批号：150313061）、甘草（批号：150280731）、金银花（批号：15051904），药品购买于东直门医院药房，然后在实验室水煎浓缩制取，分装4 ℃保存。
1.1.3 试剂与仪器 苏木精染色液、伊红溶液（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLT-9610，ZLT-9613）;IL-6、核因子-κB抗体（Abcam公司，美国，ab8227，ab208113）;三步法免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，SP-9000）;DAB显色试剂盒（北京Solarbio有限公司，20170628）。光学显微镜（OLYMPUS公司，日本，OLYMPUS BX60）;体视镜（上海勤奋仪器厂，XTT型000037）;低温多用途离心机（eppendorf公司，德国，Centrifuge 5424R）;全自动生化测定仪（BECKMAN COULTER公司，美国，AU5800）;组织切片机（Arcadia公司，德国，RM2135）;组织包埋机（Arcadia公司，德国，EG1150）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备
所有动物饲养条件：室温保持22～24 ℃，12 h交替照明，相对湿度50%，饮水不限，自由摄食。适应性喂养1周后，10只C57BL/6J为正常对照组（N组），将20只ApoE-/-小鼠随机分为模型组（M组）、四妙勇安汤组（SM组），每组10只。
1.2.2 干预方法
M、SM组均给予高脂饲料进行喂养，同时SM组以四妙勇安汤浓缩液34.9 g/kg灌胃[8]，N组和M组给予等量生理盐水灌胃，均1次/d，连续灌胃14周。
1.2.3 检测指标与方法
1）一般状况：对各组小鼠每14天测1次体质量、进食量。观察各组小鼠的饮水量、毛发、精神活动、大小便、皮肤瘀点瘀斑等一般情况。
2）血脂测定：灌胃14周后进行取材，取材前夜禁食但不禁水，采取摘除眼球取血方式，以4 ℃、2 500×g的条件下离心20 min，分离血清，然后取上清液;最后使用全自动生化分析仪检测血清的三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）指标。
3）病理学检测：摘眼球取血后，取小鼠肝脏及主动脉根部，并放置于4%多聚甲醛中固定24 h，脱水后进行石蜡包埋，制片的厚度为3 μm，连续切片，进行HE染色。在光镜下观察小鼠主动脉、肝脏病理形态，并在100倍光镜下，随机选择3个视野进行采集图像。用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件对主动脉HE染色片子进行图像分析，并测量血管内膜厚度（IT）、血管管腔面积（LA）、斑块面积（PA）、中膜厚度（MT）及IT/MT，取其平均值进行统计学分析。见图1。4）主动脉免疫组织化学检测：制片方法同HE染色，按照试剂盒说明书对样本进行染色、观察及评分。镜下染色无色为阴性，计0分;呈淡黄色为弱阳性，计1分;呈棕黄色则为阳性，计2分;呈黄褐色视作强阳性细胞，计3分。每张切片选取相同位置的5个视野打分[9]。 1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件分析数据，实验数据进行正态分布及方差齐性统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析比较多组之间数据平均数，采用LSD法进行组间两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
高脂饲养2周后，与N组比较，M组出现小鼠皮毛不整、无光泽，饮食量增多，其余症状未见明显异常。4周后，SM组小鼠皮毛光泽度较M组稍有改善，其余症状未见明显异常。小鼠体质量变化情况见表1。
2.2 各组小鼠血脂比较
与N组比较，模型组小鼠TC、HDL-C、LDL-C均明显高于N组，差异有统计学意义（P<0.05）;与M组比较，SM组TC、HDL-C、LDL-C均明显高于M组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
2.3 肝脏、主动脉病理学观察
主动脉HE染色显示，N组小鼠主动脉内皮细胞及平滑肌细胞排列整齐规则，内膜完整，未见斑块。與N组比较，M组小鼠主动脉根部形成明显AS斑块，内皮细胞排列紊乱，内膜明显增厚，中膜平滑肌排列紊乱且萎缩变薄，IT、PA、IT/MT、PA/LA明显增大，LA明显减小，差异有统计学意义（P<0.05）;与M组比较，SM组均有所改善。各组小鼠的主动脉组织病理结果见图2～3。
肝脏HE染色显示：N组小鼠的肝小叶结构清晰完整，肝细胞索排列整齐呈放射状，无脂肪变性细胞，无炎性反应和坏死的细胞。与N组小鼠比较，M组小鼠的肝小叶界限不清晰，出现球形脂滴，炎性反应细胞浸润;与M组比较，SM组肝组织病理形态改善，炎性细胞浸润和球形脂滴相对减少。各组小鼠肝组织病理观察结果见图4。
2.4 小鼠主动脉组织IL-6、NF-κB表达情况
免疫组织化学染色结果显示：主动脉核因-κB阳性表达主要位于内膜内皮细胞及中膜平滑肌的细胞核中，同时胞质中也少量分布，可见棕色染色颗粒;IL-6阳性表达主要位于内膜内皮细胞及中膜平滑肌的胞质中，可见棕色染色颗粒。N组未见棕染颗粒或少量棕染颗粒。M组可见大量胞核、胞质被棕染，较正常组阳性表达多，差异有统计学意义（P<0.05）;与M组比较，SM组细胞核、细胞质染色明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5～6，表3。
3 讨论
AS是导致急性心血管病事件发病的主要病因，《中国心血管病报告2018》发布人类死亡的首要因素是急性心脑血管疾病，约占总死亡率的70%[10]。目前，防治AS多采用调控血脂、稳定斑块等方法或采用动脉内膜剥脱术等手段进行治疗[11]。因AS发病原因多样，病理过程复杂，因此临床上常规治疗手段及西医药物均不能有效防控AS的发生[12]。中医基础理论及思维方法在防控AS方面具有独特优势，临床和实验研究中有近百种中药复方对防治AS有积极作用[13]。辨证论治是中医学的基本原则之一，是中医治疗疾病的特色，是个体化治疗的基础，所以在研究AS中医防治时，中医证型的诊断就尤为重要。动物模型有助于进行高效、经济的发病机制研究。AS动物模型是研究AS疾病的主要方法之一[14]，因此研究与临床证型相关的动物模型的病证结合动物模型就十分重要。
目前，国内外研究AS的动物模型种类较多。采用高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠制备AS的造模方法认可度高，被广泛应用到AS的发病机制、中医药防治等各领域[15-17]，但尚未见对该动物模型开展证型分析研究。因此，本研究采用ApoE-/-小鼠并给予高脂饮食14周，建立AS疾病模型，评价该模型的中医证型。小鼠平素食肥甘厚味，伤及脾胃，脾失健运，而致气机不畅。气为血之帅，血为气之母，气血失调是痰瘀互结形成之本，气虚而至无力行血，血瘀内停。《金匮要略心典》言：“毒，邪气蕴结不解之谓”。血瘀内停日久、脏腑功能失调，气血运行紊乱，则至毒邪内生。瘀血日久内生成毒。因此，本研究从理论上推断该模型是血瘀痰湿毒损证模型。
研究发现，血瘀证可以出现全身或局部组织器官的缺血、缺氧、血循环障碍以及血液流变性和黏滞性异常而导致各组织器官血栓形成、组织变性、结缔组织增生等一系列的病理变化[18-19]。本研究选择常见血栓多发部位的主动脉进行病理检测，M组出现明显斑块，内膜可见大量泡沫细胞和胆固醇结晶沉积，血瘀症状明显。毒邪在现代医学中可以看成毒性氧自由基、炎性反应递质和血管活性物质的过度释放[20-22]。本研究选择机体处于炎性反应，作为判定毒邪内生的临床标准，并对炎性反应递质IL-6、核因子-κB进行检测，N组未见棕染颗粒，M组可见大量胞核、胞质被棕染，较正常组阳性表达多。痰湿证被广泛认可为高脂血症[23]，并常见于肝脏病理、血脂和肝功能指标异常，OGTT和ITT异常[24]。本研究选择肝脏病理和血脂指标作为评价是否为痰湿证的标准，N组小鼠肝脏病理和血脂正常。M组小鼠肝小叶界限不清晰，出现球形脂滴，炎性细胞浸润，血脂明显增高。从实验药理学研究结果显示，该模型符合血瘀痰湿毒损证模型。
SM具有抗炎、降脂、免疫调节等作用[25]，已有研究表明，SM可以降低AS家兔血清中基质金属蛋白酶-9（MMP-9），C反应蛋白（CRP）水平，减少AS斑块内脂质含量和巨噬细胞数量，且在炎性反应递质的刺激下，可抑制内皮细胞白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的分泌，从而均起到抑制炎性反应、降脂的作用[26]，发挥降低血脂、保护内皮功能，稳定斑块等作用。本研究使用SM对痰湿血瘀毒损证候动物模型进行药物反证，小鼠一般客观指标得到改善，主动脉斑块减少、主动脉IL-6、核因子-κB表达降低，肝脏球形脂滴及炎性细胞浸润相对减少，说明中医药对AS有改善作用。 綜上所述，本实验对长期高脂饲料饲养ApoE-/-小鼠制备的AS模型进行了证型评价，为痰湿血瘀毒损型进一步验证SM具有抑制炎性反应，减轻AS程度的作用，为防治AS中医药研究提供病证动物模型。然而，目前捕捉到该模型的痰湿血瘀毒损表征有限，下一步更深入研究可加入血流动力学检测、肝脏超声等现代技术手段以及更严谨、具体的动物行为学观察量表，以期达到更好的效果。
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（2020-02-13收稿 责任编辑：杨觉雄）
基金项目：国家科技重大专项（2017ZX09304019）;国家自然科学基金青年基金项目（81403365）;国家自然科学基金面上项目（81874446）
作者简介：白云绮（1994.08—），女，硕士研究生，医师，研究方向：中西医结合防治动脉粥样硬化，E-mail：1723668165@qq.com
通信作者：聂波（1977.12—），女，博士，研究员，研究方向：中医药防治动脉粥样硬化及其作用机制，中药药效物质质量标准及药物代谢，E-mail：nieboww_1977@163.com