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作者简介：姚俊(1970-)，男，湖南人，本科，助理研究员，研究方向运动生理、生化。
摘要：通过在不同负荷的运动训练状态下，观察大鼠血清BUN、Ser、尿蛋白排泄率以及肾组织TGF-β1表达的变化，研究不同负荷的运动训练对大鼠肾组织结构、功能及肾组织TGF-β1表达的影响，以及揭示肾组织TGF-p1的表达对肾脏组织结构、功能变化及运动性蛋白尿产生的作用及机制。实验结果表明：综过8周过度训练后，大鼠血清BUN、Ser及尿TP排泄率显著升高(p＜0．05)，肾组织TGF-β1表达明显增加，表明过度训练造成肾小球及肾小管超微结构的伤害，随着ECM过度堆积，发生肾间质纤维化，加剧肾单位的损害，导致肾小球滤过和肾小管重吸收功能的下降；提示过度训练导致肾组织TGF-β1表达的显著增加，是过度训练造成肾组织超微结构及功能损害的重要因素。
关键词：血清BUN；Scr；尿TP；TGF-β1；过度训练
中图分类号：G804．23 文献标识码：A 文章编号：1007-3612(2006)05-0629-03
本文通过在不同负荷的运动训练状态下，观察大鼠血清BUN、Set、尿蛋白排泄率以及肾组织TGF-β1表达的变化，研究不同负荷的运动训练对大鼠肾组织结构、功能及肾组织TGF-β1表达的影响，以及揭示肾组织TGF-β1的表达对肾脏组织结构、功能变化及运动性蛋白尿产生的作用及机制。
1 材料与方法
1．1 实验动物与喂养 选用健康雄性Wistar大鼠36只，中国医学科学院实验动物研究所提供，动物级别：二级，体重192～271g，鼠龄3～4个月，常规分笼喂养，自由饮水进食。动物室内温度21～24℃，相对湿度45％～60％，每天光照时约为7：00～19：00。
1．2 实验方法
1．2．1 运动条件 玻璃钢游泳地呈圆形，内壁光滑，直径45em，水深70em，超过大鼠身长的2倍，水温34～36℃。
1．2．2 分组与训练方案 大鼠购进后，先适应性喂养1周，然后按体重分层，随机分为3组：1)对照组(A组)14只，常规喂养，不加干预，平时不运动。2)一般游泳训练组(B组)14只，每周训练6 d，每天游泳训练1次。第1次下水游泳20min，此后逐日累加，至第1周末时游泳时间延长至每天1h，第2周末时每天游1．5h，此后维持这一运动量直至完成8周的游泳训练。3)过度训练组(C组)25只。前2周训练安排同B组，第3周末游泳时间增长到2h，第4周开始进行力竭性游泳训练；开始时大鼠尾部负重0．5％体重的重物，每天游2h，至周末增加到负体重1％的重量，第5周末增加到2％。从第6周起每至第8周训练结束，大鼠上、下午各训练1次，负3％体重的重物游泳2h，对在短时间内力竭的大鼠(沉入水底10s不能回到水面)，捞出休息5 min，然后继续再进行游泳训练，使训练时间至满2h。
1．3 取材制备与处理 各运动组大训练满8周后，次日上午继续按第8周安排的训练方案训练。B组游完1．5 h，C组大鼠负3％体重游完2h或游至力竭。A组和B、C组大鼠在完成游泳训练后即刻经腹腔注射2％戊巴比一生理盐水(5mL/ksBW)麻醉后，腹腔主动脉取全血2 mL置于玻璃试管中，并立即低温离心分离血清(4℃，300 rpm，10 min)，用于测定BUN、Scr。迅速打开腹腔，用4号针头和干燥针筒抽尽膀胱尿液，所取尿样精确定容后，装入试管-20t冰箱保存，用于尿蛋白含量测定。同时取右肾，经0℃生理盐水充分冲洗后称重，置于液氧中保存。以备肾脏组织TGF-β1表达的测定。取左肾4％戊二醛固定待作超微结构分析。
1．4 观察指标及方法 1)血清BUN、Scr的测定在日立7179A全自动生化分析仪上完成。
2)TP测定采用Perini测定法。排泄率采用ug／min表示[3]。
3)肾脏组织TGF-2表达的测定采用Western blot方法。肾组织总蛋白的提取采用RNA细胞裂解液，蛋白含量按改良Lowry法测定。取总蛋白50ug经15％SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，用丽春红染色观察转移效果并标出分子量标准。然后用含5％脱脂牛奶的TBST 4℃封闭过夜，洗膜后加入兔抗TGF-2多克隆抗体(1：100)进行杂交，再用HRP标记的羊抗兔IsC(1：200)进行二抗杂交，最后加入免疫印迹化学发光试剂(购自华美生物工程公司)显影。杂交结果在LeicaQSOOIW图像分析系统中进行吸光度分析。
肾组织超微结构检查：用日本产JEM-1200EX透射电镜观察超薄切片(×8000倍)肾小球基底膜的厚度，每张电镜切片随机选择8个包含肾小球基底膜的视野，观察基底膜厚度、系膜基质及足突变化情况，并摄像。
1．5 统计学处理 实验结果数据均以均数±标准误(×±S)表示，组间差异性比较采用方差分析、Q检验和T检验进行分析。先做齐性分析，查正态分布，不齐资料经数据转换后再统计处理。差异显著性水平为户p＜0．05。
2 实验结果
2．1 训练情况和各组减数情况 一般训练组大鼠，在训练后期能顺利完成训练任务，大鼠游完出水后活泼好动。而过度训练组大鼠，在第6周开始后，每次捞出水时，显得精疲力竭，趴在笼内喘息不止。A组因笼中斗殴死亡1只，B组因训练时发生意外死亡1只，第8周末A、B两组各随机去除1只，留12只用于实验取材。C组因尾部负重，训练意外死亡较多，个别因极度疲劳衰竭而被淘汰，第9周训练结束后，25只仅剩12只用实验取材。
2．2 过度训练对大鼠肾组织超微结构的影响对照组大鼠肾小球基底膜均匀，无增厚，系膜区不扩大，系膜细胞无明显增多，上皮足突排列整齐，结构正常(图1)。一般运动组大鼠基底膜偶见轻微增厚，系膜区不扩大，系膜细胞不增多，滤过膜结构正常，上皮足突无融合(图2)。过度运动组大鼠部分基底膜呈不规则节段性增厚，系膜基质明显增多，系膜细胞增生，上皮细胞足突广泛融合(图3)。
2．2 过度训练对大鼠血清BUN、Scr和尿TP排泄率的影响经过8周的运动训练后，B组大鼠血清BUN、Scr较A组升高，但无显著性差异。尿TP排泄率也无显著性变化。C组大鼠血清BUN、Scr较A、C两组升高显著，尿TP排泄率也较A、C两组呈现显著性升高(表1)。
与B组相比Comparedwithgroup BpP＜0．05。
2．3 过度训练对大鼠肾脏组织TGF-p：表达的影响 经过8 周的训练后，B组大鼠肾脏组织TGF-p：表达较A组增加，但无显著性差异。C组大鼠肾脏组织TGF-B，表达较A、C增加显著，分别为A组的1．21倍和B组的1．08倍(图1)。
3 分析讨论
3．1 不同运动负荷对大鼠肾组织结构及功能的影响 B组大鼠经过8周运动训练后，血清BUN和Scr较对照组升高，但无显著性差异，尿TP排泄率也无显著性升高(p＞0．05)，说明B组大鼠基本适应运动负荷的训练，肾组织结构和功能无显著性异常改变。C组大鼠经过8周运动训练后，血清BUN和Scr较对照组和B组均显著升高(p＜0．05)，尿TP排泄率也呈现显著性升高(p＜0．05)，表明C组大鼠不能适应此负荷的运动的训练，而导致肾组织结构、功能受到损害，致使肾小球滤过性和肾小管重吸收功能发生改变，导致尿TP排泄率的升高。 3．2 不同运动负荷对大鼠肾组织TGF－pl表达的影响TGF-8是一类具有多种生物学作用、多细胞来源的细胞因子，是一种25KD的同形二聚本，由20多种不同的分子构成的一个生长因子超家族，该家族至少包括5种具有高度的结构和功能同源性的TGF(β1－β5)及其它类似物。TGF-β具有调节细胞生长、分化，以及免疫抑制、免疫趋化等多种生物学功能，广泛参与机体生理与病理过程，其中尤以在组织器官免疫和非免疫损伤后的癜痕和纤维化形成过程中的作用尤为重要[4]。其对抗体组织产生的损伤反应使组织修复过程变成一种慢性的、进行性的过程，因而最终导致组织器官发生纤维化、结构破坏、功能丧失。它是迄今为止人们所发现的在纤维和结缔组织基质发生过程中最重要的细胞因子[5、6]。
肾脏是TGF-β的重要靶器官，肾小球系膜细胞含有较高浓度的TGF-β因子，而包括肾小球内所有细胞类型的肾间持成纤维细胞在内的绝大多数都有TGF-β受体。最近研究表明，通过受体使肾小体系膜细胞、上皮细胞、肾小管间质细胞分裂增殖；活化中性粒细胞和单核、巨噬细胞，释放溶酶和中性蛋白酶，活化成纤维细胞及释放原酶，导致肾组织损伤；剩激肾组织系膜细胞和成纤维细胞分裂增殖(如IL-1)等，使胶原合成增加，分泌和释放前列腺素E2IL-8、中性蛋白酶、超氧阴离子等，致使肾小球基膜破坏，系膜本质堆积，TGF-β还能提高ECM的受体一整合素mRNA水平，促进整合素亚单位在细胞表面装配[7、8]，最终导致ECM过度沉积，发生肾间质纤维化，加剧肾单位受损，严重危害了肾小球正常的滤过功能和肾小管的重吸收功能。
B组大鼠经过8周运动训练后，肾组织TGF-β1，表达量相比于对照组无明显改变(p＞0．05)，从TGF-β1指标来看，B组大鼠运动结束后尿蛋白排泄率也相比对照组无明显升高(p＞0．05)，也证明了这一点。C组大鼠经过8周运动训练后，肾组织TGF-TGF-β表达量相比对照组和B组都呈现明显增加(p＜0．05)，表明C组大鼠的运动负荷严重损害了大鼠肾小球和肾小管的正常结构，随着ECM过度堆积，发生肾间质纤维化，加剧肾单位的损害，将不可避免导致肾小球的滤过作用和肾小管重吸收功能的下降或丧失。B组大鼠运动负荷训练结束后尿TP排泄率相对于对照组和C组显著升高，也正和肾脏组织TGF-β11
4 结论
1)过度训练导致大鼠血清BUN、Scr和尿TP排泄率的明显升高，表明大鼠不能适应此负荷的运动训练，导致肾组织结构、功能受损，尿TP排泄率升高。
2)过度训练导致大鼠肾脏组织TGF-TGF-β11
参考文献：
[1]Sharma K．Thetransforminggrowthfactor-TGF-βsystemand thekidney[J]．Senin Nephrol，1993，13：116-128．
[2]WolfC，Ziyateh m．MolecularmechanismsOfdiabetic renalhypertrophy[J]．kidney，Int，1999，56：393-397．
[3]PeriniJ．Urinaryprotein determination using commassie brilliant blue in出epresenseofsodiumdodeayseccphat．[Jsw]Clini CbemiActa，1981，243：281．
[4]YamabeH，OsawaH，etal．Thrombin stimulatesproductionOfTGF-plBycultured human mesangial cells[J]．Nephrol Dial Transplant，1997，3：438-442．
[5]KaneteH，Morrissey．IncreasedexpressionOfTGF-TGF-βmRNAin01eobstr-uetws kidneyO／ratswithunilatedurealligation[J]．kidneyInternational，1993，44：313-324．
[6]RoberstAB，MccuneBK．TGF-TGF-β：RegulationOfextracellularmatrix[J]．kidney Int，1992，41：557-559．
[7]OnyAC，FineLCT．Tubular-derivedgrowthfaetofandcytokincsinthepatheogenesis Of tubuloin terstitial fibrosis：Implivation fOr human venaldiseaseprogression[J]．AmJKidneyDis，1994，23：205-209．
[8]Kagami S，BorderWA．Coordination expression Ofbeta 1 integrins andmatrixproteinsinglomemlonephritis[J]．Lablnvest，1993，69：68-76．
摘要：通过在不同负荷的运动训练状态下，观察大鼠血清BUN、Ser、尿蛋白排泄率以及肾组织TGF-β1表达的变化，研究不同负荷的运动训练对大鼠肾组织结构、功能及肾组织TGF-β1表达的影响，以及揭示肾组织TGF-p1的表达对肾脏组织结构、功能变化及运动性蛋白尿产生的作用及机制。实验结果表明：综过8周过度训练后，大鼠血清BUN、Ser及尿TP排泄率显著升高(p＜0．05)，肾组织TGF-β1表达明显增加，表明过度训练造成肾小球及肾小管超微结构的伤害，随着ECM过度堆积，发生肾间质纤维化，加剧肾单位的损害，导致肾小球滤过和肾小管重吸收功能的下降；提示过度训练导致肾组织TGF-β1表达的显著增加，是过度训练造成肾组织超微结构及功能损害的重要因素。
关键词：血清BUN；Scr；尿TP；TGF-β1；过度训练
中图分类号：G804．23 文献标识码：A 文章编号：1007-3612(2006)05-0629-03
本文通过在不同负荷的运动训练状态下，观察大鼠血清BUN、Set、尿蛋白排泄率以及肾组织TGF-β1表达的变化，研究不同负荷的运动训练对大鼠肾组织结构、功能及肾组织TGF-β1表达的影响，以及揭示肾组织TGF-β1的表达对肾脏组织结构、功能变化及运动性蛋白尿产生的作用及机制。
1 材料与方法
1．1 实验动物与喂养 选用健康雄性Wistar大鼠36只，中国医学科学院实验动物研究所提供，动物级别：二级，体重192～271g，鼠龄3～4个月，常规分笼喂养，自由饮水进食。动物室内温度21～24℃，相对湿度45％～60％，每天光照时约为7：00～19：00。
1．2 实验方法
1．2．1 运动条件 玻璃钢游泳地呈圆形，内壁光滑，直径45em，水深70em，超过大鼠身长的2倍，水温34～36℃。
1．2．2 分组与训练方案 大鼠购进后，先适应性喂养1周，然后按体重分层，随机分为3组：1)对照组(A组)14只，常规喂养，不加干预，平时不运动。2)一般游泳训练组(B组)14只，每周训练6 d，每天游泳训练1次。第1次下水游泳20min，此后逐日累加，至第1周末时游泳时间延长至每天1h，第2周末时每天游1．5h，此后维持这一运动量直至完成8周的游泳训练。3)过度训练组(C组)25只。前2周训练安排同B组，第3周末游泳时间增长到2h，第4周开始进行力竭性游泳训练；开始时大鼠尾部负重0．5％体重的重物，每天游2h，至周末增加到负体重1％的重量，第5周末增加到2％。从第6周起每至第8周训练结束，大鼠上、下午各训练1次，负3％体重的重物游泳2h，对在短时间内力竭的大鼠(沉入水底10s不能回到水面)，捞出休息5 min，然后继续再进行游泳训练，使训练时间至满2h。
1．3 取材制备与处理 各运动组大训练满8周后，次日上午继续按第8周安排的训练方案训练。B组游完1．5 h，C组大鼠负3％体重游完2h或游至力竭。A组和B、C组大鼠在完成游泳训练后即刻经腹腔注射2％戊巴比一生理盐水(5mL/ksBW)麻醉后，腹腔主动脉取全血2 mL置于玻璃试管中，并立即低温离心分离血清(4℃，300 rpm，10 min)，用于测定BUN、Scr。迅速打开腹腔，用4号针头和干燥针筒抽尽膀胱尿液，所取尿样精确定容后，装入试管-20t冰箱保存，用于尿蛋白含量测定。同时取右肾，经0℃生理盐水充分冲洗后称重，置于液氧中保存。以备肾脏组织TGF-β1表达的测定。取左肾4％戊二醛固定待作超微结构分析。
1．4 观察指标及方法 1)血清BUN、Scr的测定在日立7179A全自动生化分析仪上完成。
2)TP测定采用Perini测定法。排泄率采用ug／min表示[3]。
3)肾脏组织TGF-2表达的测定采用Western blot方法。肾组织总蛋白的提取采用RNA细胞裂解液，蛋白含量按改良Lowry法测定。取总蛋白50ug经15％SDS-PAGE凝胶电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，用丽春红染色观察转移效果并标出分子量标准。然后用含5％脱脂牛奶的TBST 4℃封闭过夜，洗膜后加入兔抗TGF-2多克隆抗体(1：100)进行杂交，再用HRP标记的羊抗兔IsC(1：200)进行二抗杂交，最后加入免疫印迹化学发光试剂(购自华美生物工程公司)显影。杂交结果在LeicaQSOOIW图像分析系统中进行吸光度分析。
肾组织超微结构检查：用日本产JEM-1200EX透射电镜观察超薄切片(×8000倍)肾小球基底膜的厚度，每张电镜切片随机选择8个包含肾小球基底膜的视野，观察基底膜厚度、系膜基质及足突变化情况，并摄像。
1．5 统计学处理 实验结果数据均以均数±标准误(×±S)表示，组间差异性比较采用方差分析、Q检验和T检验进行分析。先做齐性分析，查正态分布，不齐资料经数据转换后再统计处理。差异显著性水平为户p＜0．05。
2 实验结果
2．1 训练情况和各组减数情况 一般训练组大鼠，在训练后期能顺利完成训练任务，大鼠游完出水后活泼好动。而过度训练组大鼠，在第6周开始后，每次捞出水时，显得精疲力竭，趴在笼内喘息不止。A组因笼中斗殴死亡1只，B组因训练时发生意外死亡1只，第8周末A、B两组各随机去除1只，留12只用于实验取材。C组因尾部负重，训练意外死亡较多，个别因极度疲劳衰竭而被淘汰，第9周训练结束后，25只仅剩12只用实验取材。
2．2 过度训练对大鼠肾组织超微结构的影响对照组大鼠肾小球基底膜均匀，无增厚，系膜区不扩大，系膜细胞无明显增多，上皮足突排列整齐，结构正常(图1)。一般运动组大鼠基底膜偶见轻微增厚，系膜区不扩大，系膜细胞不增多，滤过膜结构正常，上皮足突无融合(图2)。过度运动组大鼠部分基底膜呈不规则节段性增厚，系膜基质明显增多，系膜细胞增生，上皮细胞足突广泛融合(图3)。
2．2 过度训练对大鼠血清BUN、Scr和尿TP排泄率的影响经过8周的运动训练后，B组大鼠血清BUN、Scr较A组升高，但无显著性差异。尿TP排泄率也无显著性变化。C组大鼠血清BUN、Scr较A、C两组升高显著，尿TP排泄率也较A、C两组呈现显著性升高(表1)。
与B组相比Comparedwithgroup BpP＜0．05。
2．3 过度训练对大鼠肾脏组织TGF-p：表达的影响 经过8 周的训练后，B组大鼠肾脏组织TGF-p：表达较A组增加，但无显著性差异。C组大鼠肾脏组织TGF-B，表达较A、C增加显著，分别为A组的1．21倍和B组的1．08倍(图1)。
3 分析讨论
3．1 不同运动负荷对大鼠肾组织结构及功能的影响 B组大鼠经过8周运动训练后，血清BUN和Scr较对照组升高，但无显著性差异，尿TP排泄率也无显著性升高(p＞0．05)，说明B组大鼠基本适应运动负荷的训练，肾组织结构和功能无显著性异常改变。C组大鼠经过8周运动训练后，血清BUN和Scr较对照组和B组均显著升高(p＜0．05)，尿TP排泄率也呈现显著性升高(p＜0．05)，表明C组大鼠不能适应此负荷的运动的训练，而导致肾组织结构、功能受到损害，致使肾小球滤过性和肾小管重吸收功能发生改变，导致尿TP排泄率的升高。 3．2 不同运动负荷对大鼠肾组织TGF－pl表达的影响TGF-8是一类具有多种生物学作用、多细胞来源的细胞因子，是一种25KD的同形二聚本，由20多种不同的分子构成的一个生长因子超家族，该家族至少包括5种具有高度的结构和功能同源性的TGF(β1－β5)及其它类似物。TGF-β具有调节细胞生长、分化，以及免疫抑制、免疫趋化等多种生物学功能，广泛参与机体生理与病理过程，其中尤以在组织器官免疫和非免疫损伤后的癜痕和纤维化形成过程中的作用尤为重要[4]。其对抗体组织产生的损伤反应使组织修复过程变成一种慢性的、进行性的过程，因而最终导致组织器官发生纤维化、结构破坏、功能丧失。它是迄今为止人们所发现的在纤维和结缔组织基质发生过程中最重要的细胞因子[5、6]。
肾脏是TGF-β的重要靶器官，肾小球系膜细胞含有较高浓度的TGF-β因子，而包括肾小球内所有细胞类型的肾间持成纤维细胞在内的绝大多数都有TGF-β受体。最近研究表明，通过受体使肾小体系膜细胞、上皮细胞、肾小管间质细胞分裂增殖；活化中性粒细胞和单核、巨噬细胞，释放溶酶和中性蛋白酶，活化成纤维细胞及释放原酶，导致肾组织损伤；剩激肾组织系膜细胞和成纤维细胞分裂增殖(如IL-1)等，使胶原合成增加，分泌和释放前列腺素E2IL-8、中性蛋白酶、超氧阴离子等，致使肾小球基膜破坏，系膜本质堆积，TGF-β还能提高ECM的受体一整合素mRNA水平，促进整合素亚单位在细胞表面装配[7、8]，最终导致ECM过度沉积，发生肾间质纤维化，加剧肾单位受损，严重危害了肾小球正常的滤过功能和肾小管的重吸收功能。
B组大鼠经过8周运动训练后，肾组织TGF-β1，表达量相比于对照组无明显改变(p＞0．05)，从TGF-β1指标来看，B组大鼠运动结束后尿蛋白排泄率也相比对照组无明显升高(p＞0．05)，也证明了这一点。C组大鼠经过8周运动训练后，肾组织TGF-TGF-β表达量相比对照组和B组都呈现明显增加(p＜0．05)，表明C组大鼠的运动负荷严重损害了大鼠肾小球和肾小管的正常结构，随着ECM过度堆积，发生肾间质纤维化，加剧肾单位的损害，将不可避免导致肾小球的滤过作用和肾小管重吸收功能的下降或丧失。B组大鼠运动负荷训练结束后尿TP排泄率相对于对照组和C组显著升高，也正和肾脏组织TGF-β11
4 结论
1)过度训练导致大鼠血清BUN、Scr和尿TP排泄率的明显升高，表明大鼠不能适应此负荷的运动训练，导致肾组织结构、功能受损，尿TP排泄率升高。
2)过度训练导致大鼠肾脏组织TGF-TGF-β11
参考文献：
[1]Sharma K．Thetransforminggrowthfactor-TGF-βsystemand thekidney[J]．Senin Nephrol，1993，13：116-128．
[2]WolfC，Ziyateh m．MolecularmechanismsOfdiabetic renalhypertrophy[J]．kidney，Int，1999，56：393-397．
[3]PeriniJ．Urinaryprotein determination using commassie brilliant blue in出epresenseofsodiumdodeayseccphat．[Jsw]Clini CbemiActa，1981，243：281．
[4]YamabeH，OsawaH，etal．Thrombin stimulatesproductionOfTGF-plBycultured human mesangial cells[J]．Nephrol Dial Transplant，1997，3：438-442．
[5]KaneteH，Morrissey．IncreasedexpressionOfTGF-TGF-βmRNAin01eobstr-uetws kidneyO／ratswithunilatedurealligation[J]．kidneyInternational，1993，44：313-324．
[6]RoberstAB，MccuneBK．TGF-TGF-β：RegulationOfextracellularmatrix[J]．kidney Int，1992，41：557-559．
[7]OnyAC，FineLCT．Tubular-derivedgrowthfaetofandcytokincsinthepatheogenesis Of tubuloin terstitial fibrosis：Implivation fOr human venaldiseaseprogression[J]．AmJKidneyDis，1994，23：205-209．
[8]Kagami S，BorderWA．Coordination expression Ofbeta 1 integrins andmatrixproteinsinglomemlonephritis[J]．Lablnvest，1993，69：68-76．